棉花耐盐基因筛选及酪氨酸蛋白磷酸酶基因功能研究

发布时间：2018-01-04 16:14

  本文关键词：棉花耐盐基因筛选及酪氨酸蛋白磷酸酶基因功能研究　出处：《中国农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上重要的纺织纤维作物和油料作物。目前,盐胁迫构成了影响棉花生长、产量和纤维品质的主要危害。随着现代分子生物技术的飞速发展,植物抗盐基因工程研究已取得了一定成绩,但由于生物抗盐性是由多基因控制的数量性状,其生理、生化过程是基因相互作用、共同调节的结果,因此发掘棉花盐相关基因,探究棉花耐盐途径仍是研究棉花抗盐性的重要目标。本研究建立了棉花在水培条件下病毒诱导的基因沉默(Virus induce gene silencing,VIGS)体系,筛选出棉花多种盐相关基因；成功克隆出棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTP1基因,揭示了GhPTP1基因在棉花盐响应途径中起负调控作用,并在酵母双杂交文库中筛选GhPTP1作用蛋白。研究结果如下：成功建立了水培条件下棉花VIGS基因沉默体系。在24℃C条件下,出苗后5天内进行注射能得到较高沉默效率,重悬液浓度对沉默效率没有影响,同时以注射pTRV-GFP做空白对照可以消除插入片段对植株生长的影响,减小对照误差；水培与土培方式相比能更快更早出现沉默表型,缩短实验周期,并能诱导水培条件下不同品种棉花材料GhCLA1基因沉默；利用水培棉花TRV-VIGS体系,成功抑制了棉花GhCTRl基因的表达,与对照株相比,抑制后的棉花植株出现矮化表型。通过筛选VIGS-cDNA文库,沉默棉花未知基因,获得一系列耐盐及盐敏感表型,测序结果显示候选基因主要编码与光合作用相关的蛋白、编码磷酸酶、ACR家族蛋白和功能未知蛋白等。本研究根据前期测序结果,克隆了棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTPl基因,该基因全长849bp,编码283个氨基酸,具有家族特征性序列(V/I)HCXXGXXR(S/T)。序列同源比对分析显示GhPTPl与梅花、橙子、葡萄、可可、烟草蛋白有较高同源性。GhPTP1与拟南芥AtDSP8和AtDSP10属于同一分支。组织特异性表达及亚细胞定位结果表明,GhPTPl基因在棉花根、叶中表达较高,并定位于细胞膜。qRT-PCR结果显示,GhPTPl基因表达量在棉花不同组织部位均受盐胁迫诱导上调。在ABA及PEG诱导处理下,该基因表达上调,H2O2则诱导基因下调,提示GhPTP1可能参与植物逆境胁迫下的信号通路。GhPTP1基因沉默植株在盐浓胁迫下表现出明显抗盐表型,干物重显著高于对照,且VIGS-GhP TP1植株中的GhNHX1、GhSOS和GhSOS2的基因表达量高于对照；在拟南芥中,GhPTP1过表达提高了植株对盐的敏感性,子叶变绿率和根长均低于对照,植株Na+积累量则高于对照植株,结果表明GhPTPl在棉花盐响应信号途径中起负调控作用。同时GhPTP1基因沉默降低了植株对渗透胁迫的敏感性,其叶片相对含水量与对照相比显著增加,失水率低于对照,转GhPTPl基因拟南芥表现出了明显的干旱胁迫表型。结果表明GhPTPl能够参与NaCl引起的渗透胁迫及Na+胁迫途径,并通过参与SOS途径影响植株Na+含量。本研究利用酵母双杂交技术筛选到30多个GhPTP1的互作蛋白,这些蛋白包括转录因子、结合蛋白、离子转运相关蛋白等。免疫共沉淀及烟草瞬时表达试验验证了GhPTP1与GhANN5的互作关系,且盐胁迫可诱导GhPTP1与GhANN5的互作。
[Abstract]:Cotton (Gossypium hirsutum L.) is a textile fiber crop and oil crop in the world. At present, the impact of salt stress of cotton growth, yield and fiber quality of the main hazards. With the rapid development of modern molecular biology, studies on the salt tolerance of plant genetic engineering has made some achievements, but due to the biological salt resistance quantitative trait controlled by multiple genes, their physiological and biochemical process of gene interactions, CO regulation results, so to explore cotton genes related to salt tolerance of cotton cotton, an important goal of inquiry way is still the salt of the salt tolerance. This study established a virus induced gene silencing cotton in Hydroponic conditions (Virus induce gene silencing, VIGS) system, selected a variety of cotton salt related gene; clone cotton protein tyrosine phosphatase GhPTP1 gene revealed that GhPTP1 gene in cotton salt response pathway The negative regulation, and screening of GhPTP1 interacting protein in yeast two hybrid library. The results were as follows: successfully established cotton VIGS gene silencing system under hydroponic conditions. At 24 DEG C under the condition of 5 days after emergence of injection can achieve high silencing efficiency re suspension concentration has no effect on the silencing efficiency at the same time. In the case of pTRV-GFP as blank insert can eliminate the impact on the growth of seedlings, reduce the control error; water culture and soil culture than faster earlier silent phenotype, shorten the experimental period, and different varieties of cotton GhCLA1 gene silencing induced by hydroponics culture; hydroponic cotton TRV-VIGS system successfully inhibited the expression of GhCTRl gene in cotton, compared with the control plants, cotton plants after inhibition of dwarf phenotype. By screening the VIGS-cDNA library, silent cotton unknown gene, obtained a series of salt and The salt sensitive phenotype, the sequencing result showed that the main candidate gene encoding and photosynthesis related protein, encoding phosphatase, ACR family proteins and unknown function protein. This study based on the results of the preliminary sequencing of cloned cotton protein tyrosine phosphatase GhPTPl gene, the gene of full length 849bp encoding 283 amino acids, with family characteristic sequence (V/I) HCXXGXXR (S/T). Sequence homology analysis showed that GhPTPl and plum, orange, grape, cocoa, tobacco protein has high homology with Arabidopsis.GhPTP1 AtDSP8 and AtDSP10 belong to the same branch. Tissue specific expression and subcellular localization showed that GhPTPl gene in cotton root, higher expression in leaves, and located on the cell membrane.QRT-PCR the results showed that GhPTPl gene expression was induced by salt stress increased in different tissues of cotton. In ABA and PEG induced treatment, expression of the gene H2O2 is induced Gene expression, suggesting that GhPTP1 may be involved in the signaling pathway of.GhPTP1 gene silencing plants under abiotic stress in plant salt stress concentration showed obvious salt resistant phenotype, dry weight was significantly higher than that of control, VIGS-GhP and TP1 in the plants of GhNHX1, GhSOS and GhSOS2 gene expression was higher than that of the control; in Arabidopsis, overexpression of GhPTP1 increased the sensitivity of plants to salt, cotyledon greening rate and root length were lower than the control plants, the accumulation of Na+ is higher than that of the control plants, the results show that the GhPTPl response plays a negative regulatory role of signaling pathways in the cotton salt. At the same time GhPTP1 gene silencing reduced the sensitivity of plants to osmotic stress, the relative water content of leaves significantly compared with control increase the rate of water loss was lower than that of control, GhPTPl transgenic Arabidopsis showed significant drought phenotype. The results showed that GhPTPl could be involved in NaCl induced osmotic stress and Na+ stress pathway, And through participation in the content of Na+ SOS. The influence of plants. This study using yeast two hybrid screening interaction protein of more than 30 GhPTP1, including transcription factor binding proteins, these proteins, ion transport related protein. Co immunoprecipitation and tobacco transient expression test verified the interaction between GhPTP1 and GhANN5, and salt stress each other as can be induced by GhPTP1 and GhANN5.

【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S562;Q943.2

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本文编号：1379131