鸡钠氢交换蛋白1介导的Wnt信号通路在J亚群禽白血病病毒感染中的作用

发布时间：2018-01-04 18:04

  本文关键词：鸡钠氢交换蛋白1介导的Wnt信号通路在J亚群禽白血病病毒感染中的作用　出处：《山东农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)能引起鸡生长迟缓、免疫抑制和肿瘤等疾病,给我国养禽业造成重大经济损失,目前尚无有效的疫苗和药物予以防治,其感染致病机制亟须进一步深入研究。鸡钠氢交换蛋白1(chicken sodium hydrogen exchanger isoform 1,ch NHE1)是普遍存在于真核细胞质膜的一种跨膜蛋白,通过介导细胞外Na+和细胞内H+的交换来调节细胞内p H值,在生理和病理过程中发挥重要作用。ch NHE1同时也是ALV-J的受体,其在ALV-J感染中的作用至今未明。病毒与宿主细胞受体结合是实现其感染的第一步,也是最为关键的一步。因此,明确ch NHE1在ALV-J感染过程中的功能变化及这种变化对细胞内信号通路与细胞表型的影响,对于解析ALV-J的致病机制及开发新的防控药物至为重要。为此,我们首先设计实验研究ALV-J是否对ch NHE1有调节作用,有何种调节作用。我们用103 TCID50的ALV-J病毒感染DF-1细胞,在感染后的不同时间点收集细胞;然后用101、103和104 TCID50的ALV-J毒株感染DF-1细胞,在感染后的72 h收集细胞;最后通过RT-PCR和real-time PCR技术检测ALV-J和ch NHE1在m RNA水平的表达。结果显示,ALV-J对ch NHE1的表达有上调作用,且ch NHE1的表达具有时间依赖性,呈现波浪式升高;但ch NHE1的表达无病毒滴度依赖性,104 TCID50感染时ch NHE1的表达量反而低于101和103 TCID50组。接下来我们应用103 TCID50的ALV-J毒株感染DF-1细胞,在感染后的不同时间点通过荧光分光光度计检测细胞内p H值。结果显示,ALV-J感染可导致细胞内p H快速升高,至24 h时达到7.7,随后在72 h和120 h时略有下降,说明ALV-J可通过上调ch NHE1表达而升高细胞内p H。最后我们通过体内实验验证ALV-J对ch NHE1的调节。成功建立ALV-J感染SPF鸡模型后,选取肾脏组织提取RNA,经RT-PCR和real-time PCR检测ALV-J和ch NHE1在m RNA水平的表达。结果显示,接毒组中ch NHE1的表达量显著高于对照组。我们进一步通过免疫组织化学技术检测ch NHE1在不同组织中的表达与分布。实验结果显示,在肾脏、肝脏、骨髓和胸腺等组织中,ALV-J感染组中ch NHE1的蛋白表达显著高于对照组;而在脾脏和法氏囊组织中,ch NHE1的表达没有明显的变化。总之,本实验证明ALV-J感染能上调ch NHE1的表达与功能,并推测ch NHE1的上调在ALV-J诱导肿瘤发生中发挥重要作用。ALV-J与ch NHE1结合后进入细胞,通过宿主基因组进行转录、翻译及病毒的组装释放,在这个过程中多种信号通路发挥了重要作用。既往研究表明,Wnt信号通路涉及多种病毒的感染,但其在ALV-J感染中的研究尚未见报道。为证明ALV-J感染是否对Wnt通路有调节作用,有何种调节作用,我们设计了以下实验。应用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,在感染后的不同时间点应用western blot技术检测β-catenin的表达。实验结果显示,ALV-J感染会导致β-catenin蛋白表达水平下降;与此同时我们检测了ALV-J感染后120 h细胞核内β-catenin的表达,结果显示,ALV-J感染细胞核内β-catenin蛋白表达水平也显著低于对照组。然后我们用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,在感染后的不同时间点应用real-time PCR技术检测转录因子Tcf1、Tcf4和Lef1的表达。实验结果显示,ALV-J感染显著抑制了Tcf4和Lef1的表达,而Tcf1的表达无显著降低。接下来我们检测了Wnt通路下游的靶基因,应用103TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,在感染后的不同时间点应用real-time PCR技术检测Axin2、Cyclin D1、c-myc和MMP-7在m RNA水平的表达。结果显示,ALV-J感染下调了Axin2和Cyclin D1的表达,而与肿瘤发生相关的c-myc和MMP-7的表达发生了上调。我们进一步检测了ALV-J感染后的细胞周期与细胞凋亡,应用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,于感染后48 h通过流式细胞术检测细胞周期。实验结果显示,G2/M期细胞所占比例出现明显上升,表明细胞周期受到阻滞。我们应用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,在感染后的不同时间点应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。实验结果显示,ALV-J感染能够抑制细胞增殖,在第5 d和第7 d,感染组细胞的增殖速率显著低于对照组,表明细胞增殖受到抑制。最后我们设计了相关体内实验,通过免疫组织化学技术检测β-catenin在肌肉、法氏囊和脾脏组织中的表达与分布。实验结果显示,对于肌肉组织,ALV-J感染后β-catenin的表达显著低于对照组;对于法氏囊组织,β-catenin在对照组法氏囊皮质和髓质交界处网状细胞呈高表达,而ALV-J感染后其表达出现明显下降;对于脾脏组织,β-catenin在对照组血管内皮细胞、窦内皮细胞、红髓部位呈高表达,而ALV-J感染后其表达出现明显下降。以上实验证明ALV-J感染后能下调Wnt信号通路,且Wnt通路下调可能是导致鸡生长迟缓和免疫抑制的机制之一。为研究ALV-J感染时ch NHE1通过何种机制下调Wnt信号通路,我们首先用103TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,在感染后的不同时间点应用western blot技术检测GSK3β、p-GSK3β-ser9和p-GSK3β-tyr216的表达。实验结果显示,GSK3β蛋白表达水平并未发生明显变化;p-GSK3β-ser9蛋白在ALV-J感染前期并未出现明显变化,仅在120 h时出现上调;而p-GSK3β-tyr216蛋白在ALV-J感染后出现显著上调。为探寻何种机制导致p-GSK3β-tyr216表达上调,我们用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,在感染后的不同时间点通过western blot技术检测p-PYK2和ERK的表达。实验结果显示,ALV-J感染后p-PYK2蛋白表达水平出现下降,而ERK蛋白表达水平在ALV-J感染后并未出现明显变化。接下来我们用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF细胞,在感染后的6 h时通过活细胞工作站检测细胞内Ca2+浓度的变化。实验结果显示,ALV-J感染导致细胞内Ca2+的浓度显著上升。最后我们通过体内实验进行了相关验证。选取ALV-J感染组与对照组鸡的肌肉组织,应用免疫组织化学技术检测p-GSK3β-tyr216在肌肉组织中的表达与分布。实验结果显示,ALV-J感染组中p-GSK3β-tyr216的表达显著高于对照组。本实验证明ALV-J感染能引起细胞内Ca2+浓度升高和p-GSK3β-tyr216表达上调,进而导致Wnt信号通路下调,并推测ch NHE1介导Wnt信号通路下调可能是ALV-J诱导鸡生长迟缓的重要机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31

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本文编号：1379484