茶树育性相关基因的克隆与表达研究
本文关键词：茶树育性相关基因的克隆与表达研究 出处：《华中农业大学》2017年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：茶树是一种广泛种植的经济作物,由于自交不亲和、杂交结实率低和品种间杂交结实率差异大,导致茶树遗传背景复杂、杂交育种效率低,限制了遗传学研究和遗传改良相关工作的开展。本研究以茶树自交不亲和机制为切入点,使用转录组学的方法,发掘茶树育性相关基因,对关键基因进行克隆,并通过基因分型、基因表达和蛋白的原核表达等手段,研究关键基因在茶树育性分子机制中的作用。本研究主要结果如下:1.使用荧光显微镜观察自交(‘福鼎大白茶’ב福鼎大白茶’)和异交(‘福鼎大白茶’ב中茶108’)授粉花柱中花粉管的生长差异。发现授粉24 h~48 h自交花粉管的生长速度明显慢于异交花粉管;授粉72 h,异交和自交花粉管均长至花柱基部。表明自交花粉管在花柱中的生长受到了一定程度的抑制,到达花柱基部的时间有明显延迟。2.为了明确自交花粉管生长受抑的分子机制,本文使用转录组学的方法研究了茶树自交(self-pollination,SP)和异交(cross-pollination,CP)授粉24 h、48 h和72 h后花柱中基因表达的差异。独立构建6个转录组测序文库(CP24、CP48、CP72、SP24、SP48和SP72)分别进行测序,共得到了63762个Unigene。通过比较SP和CP样本间的转录组数据,筛选到大量的差异表达基因,其中包括Ca2+信号转导、细胞凋亡、植物-病原菌互作和活性氧代谢等过程相关的基因,为茶树育性相关重要基因的筛选奠定了基础。然后研究了SP和CP样本中随授粉时间变化的基因表达规律,发现花柱对自花和异花花粉管具有完全不同的响应模式,其中83个参与氧化还原过程基因的上调表达在SP样本中有明显的延迟,与自交花粉管生长受抑的表型一致,推测这些基因可能直接参与了花粉管生长的调控。3.对自交和异交授粉的茶树子房进行了转录组测序,拼接得到51200个Unigene。与根、叶片和花柱的转录组数据进行比较,筛选到99个在茶树子房中特异表达的基因,这些基因在花粉-雌蕊互作、花粉管引导和双受精过程中具有重要功能。使用荧光定量PCR的方法,研究了51个与IAA、乙烯、ABA和GA信号转导相关Unigene,在SP和CP授粉子房中的表达规律,筛选到6个表达规律具有显著差异的Unigene,分别为:GID1、SAUR、GH3.6、GH3.1、IAA29和ARF1,这些基因可能在茶树花粉管-子房互作阶段具有重要功能。4.S-RNase基因是配子体型自交不亲和机制(gametophytic self-incompatibility,GSI)中的雌性决定因子。本研究从转录组差异表达基因中,筛选并克隆了一个Cs S-RNase基因(KU852488),该基因全长1121 bp,开放阅读框全长717 bp,编码283个氨基酸残基;该基因主要在花柱中表达;自交授粉花柱中Cs S-RNase的上调表达明显早于异交花柱,且授粉24 h自交花柱中表达量显著高于异交花柱,与自花花粉管受抑时间一致。检测该基因在11个茶树品种(系)中的基因型,发现该基因存在丰富的遗传多态性。然后将Cs S-RNase定位到了实验室构建的遗传图谱上。对Cs S-RNase基因进行原核表达,成功分离到了目标蛋白。使用不同Cs S-RNase蛋白浓度的培养基培养花粉,发现Cs S-RNase能够明显抑制自花花粉管的生长。以上结果表明Cs SRNase符合GSI植物S-RNase基因的典型特征,认为茶树自交不亲和性在分子机制上受GSI机制控制。5.从转录组数据中筛选到14个具有完整开放阅读框的钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)基因。使用荧光定量PCR检测CDPKs的组织表达特异性,发现5个Cs CDPKs基因在花粉中特异表达。然后克隆了这5个Cs CDPKs的c DNA全长序列。同源比对发现,它们与多个拟南芥中参与花粉管极性生长的CDPKs有较高的同源性。5个Cs CDPKs随着花粉培养时间的延长,表达量呈上升趋势,其中Cs CPK3、Cs CPK4和Cs CPK5在花粉培养初始阶段便有快速响应。进一步选择了Cs CPK5设计并合成了硫代修饰的反义寡核苷酸链,对该基因在茶树花粉管中的表达进行特异性的沉默,发现能够抑制花粉管的生长,因此Cs CPK5在茶树花粉管的生长过程中具有重要的功能。
[Abstract]:In order to clarify the molecular mechanism of pollen tube growth , it was found that the growth rate of selfing pollen tube was obviously slower than that of pollen tube . The results showed that the growth rate of selfing pollen tube was obviously slower than that of pollen tube . The expression of Cs S - RNase gene in pollen tube - ovary was studied by fluorescence quantitative PCR . The results showed that the expression of Cs S - RNase was significantly higher than that in the pollen tube . The specific silencing of the expression of the gene in the pollen tube of the tea tree shows that the growth of the pollen tube can be inhibited , so that the Cs CP5 can play an important function in the growth process of the tea tree pollen tube .
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S571.1
【参考文献】
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，本文编号：1434653
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