犬弓形虫急性感染血清中标志蛋白的筛选及其功能与应用研究

发布时间：2018-01-19 07:10

  本文关键词： 弓形虫 急性感染 抗原蛋白谱 蛋白表达 诊断 基因敲除　出处：《南京农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：弓形虫是一种世界范围内寄生的原虫,可导致人畜流产、死胎和免疫抑制患者死亡,临床表现复杂,确诊困难,缺少有效的治疗药物,给公共卫生和畜牧业带来极大危害。弓形虫循环抗原(Circulating Antigens,CAg)是急性感染期虫体自身排泄和裂解产物,CAg阳性提示弓形虫病急性、活动性感染,是早期感染的可靠指标。排泄-分泌抗原(Excretory / Secretory Antigens,ESA)是CAg的主要成分。寻找弓形虫早期感染相关的蛋白,深入了解弓形虫的致病机理和发现新型诊断候选分子是当前动物弓形虫病研究亟待解决的问题。蛋白质组学在寻找诊断标记、药物靶标和弓形虫毒力因子方面具有广泛优势,因此可以利用蛋白质组学全面了解弓形虫急性感染动物血清中循环抗原的组成。本研究了建立弓形虫急性感染犬模型,利用蛋白组学技术鉴定宿主血清中与弓形虫急性感染相关的标志蛋白及毒力因子,并选取与弓形虫致病机理有关的新鉴定的循环抗原进行功能与应用研究,旨在发现新的诊断候选蛋白和毒力因子并进一步阐述弓形虫急性感染的的致病机理。试验一:免疫沉淀-shotgun以及免疫二维电泳鉴定弓形虫急性感染血清中的标记蛋白在本试验中,首先制备ESA及其鼠源多克隆抗体,通过将健康比格犬腹腔内注射1X109纯化速殖子建立急性感染模型,感染后每天监测体温并采血,提取血液DNA进行套式PCR检测弓形虫,同时采集血液监测血细胞、生化指标以及弓形虫循环抗原及其抗体水平;弓形虫急性感染犬模型感染后2-3 d的血清以蛋白酶抑制剂处理,利用Protein A去除犬血清IgG后,以免疫沉淀技术富集弓形虫急性感染犬血清中的CAg,将富集成分进行膜辅助蛋白质组样品制备,酶解后用于LC-MS/MS检测;另外,ESA经双向电泳分离后,以弓形虫急性感染犬第18d血清作为一抗进行Western-blot分析,将Western-blot结果与经考马斯亮兰或银染色的2-DE凝胶对比,切取匹配的点用胰酶消化后进行质谱测定;将上述两种方法得到原始文件用Mascot 2.2软件搜索相应的数据库进行蛋白质鉴定,同时将所鉴定的蛋白进行基因本体注释(GO)分析和蛋白质相互作用分析。结果显示弓形虫急性感染24 h后,犬出现发热症状,3d后体温开始下降体温,7d后趋于正常,感染犬的PLT在第5d显著(P0.05)降低,血清ALT活力在4到12 d显著升高(P0.05),AST活力在5到12 d时也比对照组显著增高(P0.05),表明感染犬肝功能异常,血液弓形虫套式PCR检测阳性,感染后的血液中可检测到弓形虫CAg,感染后第18d CAg抗体达到峰值,上述结果表明弓形虫急性感染模型成功建立;LC-MS/MS成功鉴定了 220个蛋白质,免疫二维电泳结合串联质谱成功鉴定了8个蛋白质,3种蛋白同时被两种方法鉴定(热休克蛋白质70、蛋白质二硫键异构酶和烯醇酶2); GO结果表明所鉴定的蛋白主要参与蛋白质代谢、结合、氧化还原过程、糖代谢、应激等生物学过程以及作为细胞外成分和膜成分;蛋白质相互作用分析结果表明所鉴定的蛋白参与非同源末端连接、沙门氏菌感染、细菌性痢疾和粘着连接等病理过程的信号通路中。试验二:部分鉴定蛋白的表达、纯化及其作用机理研究根据GO分析结果及已发表的研究结果,在成功鉴定的225种蛋白中选取Coronin、ELMO、eEF2和RPL40进行原核表达及功能鉴定,构建pET-28a-c(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达后收集蛋白并进行复性及纯化,去除内毒素并检测浓度后制备四种蛋白的鼠源多克隆抗体,利用Western blotting方法验证急性感染血清中四种蛋白的存在,利用细胞免疫荧光对四种蛋白进行亚细胞定位,流式细胞术检测抗体对弓形虫入侵细胞的阻断作用,并利用致死试验和绝对荧光定量评价免疫四种重组蛋白对弓形虫(RH)感染小鼠的保护效果。结果表明,四种蛋白均存在于急性弓形虫感染小鼠的血清中;间接免疫荧光表明,Coronin主要集中在速殖子的前部,少量分布在后端和表面,ELMO主要分布在速殖子的外周,eEF2集中在虫体的一端,RPL40分散在胞质中;Coronin,EMLO,eEF2和RPLA0的抗体降低了刚地弓形虫体外入侵细胞的效率;免疫这四种蛋白延长了刚地弓形虫感染小鼠的存活时间,对弓形虫感染小鼠血液、肝脏、脾脏和脑组织中的虫体数量表现不同程度的抑制效果。试验三:重组弓形虫Coronin和EMLO蛋白在诊断弓形虫感染中的应用为鉴定和评价新的弓形虫诊断候选分子,对新发现的弓形虫循环抗原进行BLAST分析发现,弓形虫Coronin和ELMO蛋白与其他物种的同源性较低,为了检测这两种蛋白在弓形虫病诊断方面的意义,本试验对两种蛋白进行了进化树分析;建立以重组蛋白为包被抗原检测血液中弓形虫特异性IgG为基础的ELISA诊断方法,通过与标准弓形虫诊断试剂盒进行比较来评价诊断的准确性和一致性;此外,以该两种重组蛋白的多克隆抗体可以检测血液循环抗原为基础,建立弓形虫急性感染的ELISA诊断方法,通过检测本研究建立的弓形虫急性感染模型的血清样品并与与套式PCR结果对比来评价诊断效果。结果表明,两种蛋白与其他物种的进化树分析差异较大;利用两种重组蛋白建立的ELISA检测方法诊断弓形虫感染的一致性和特异性高,H值高于0.6,诊断结果可信;两种蛋白在弓形虫急性感染犬血清中的变化与循环抗原变化一致,随着虫体消失而逐渐清除,具有良好的诊断价值。试验四:弓形虫硫氧还蛋白还原酶的表达及其功能研究硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase, TR)是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶,和硫氧还蛋白及NADPH共同组成了一个有效的蛋白还原系统,称为硫氧还蛋白系统,弓形虫硫氧还蛋白还原酶不含硒代半胱氨酸,含有622个氨基酸残基。本试验对TR蛋白进行全长和分两段分别进行大肠杆菌原核表达,蛋白质复性和纯化后检测重组硫氧还蛋白还原酶的活性,并将重组蛋白切除标签后进行酶促反应动力学检测;制备鼠源多克隆抗体,利用免疫透射电镜对弓形虫TR蛋白进行亚细胞定位;利用CRISPR/CAS9基因编辑技术敲除弓形虫TR基因,并构建TR基因敲除的互补株,分别筛选单克隆虫株,利用PCR、双标免疫荧光和免疫印迹验证TR基因缺失与插入;检测基因敲除弓形虫的入侵细胞能力、增殖能力及抗氧化应激能力;检测TR基因敲除弓形虫对宿主细胞因子的产生和致病力的影响。结果表明,全长包涵体表达的重组弓形虫TR蛋白酶活力部分恢复,含有1-380氨基酸残基的片段和375-662氨基酸残基的片段可溶性表达并具有高硫氧还蛋白还原酶活性,三种重组蛋白以NADPH和DTNB为底物的Km值分别为11.47-15.57和130.48-151.09;免疫电镜观察发现,TR蛋白分布于细胞质中,其中虫体前部分布较多;PCR、免疫荧光和免疫印迹结果表明TR基因缺失株和互补株构建成功;TR基因敲除弓形虫体外入侵Vero细胞的效率降低、增殖速度减慢、虫体抗氧化能力降低;与野毒株相比,TR基因缺失对弓形虫刺激宿主产生细胞因子的能力无影响,TR基因敲除弓形虫对小鼠的毒力降低,弓形虫TR基因缺失所导致的毒力降低主要是由于虫体抗氧化系统缺陷所致。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
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本文编号：1443139