氟苯尼考在脊尾白虾体内药代动力学及药效学研究

发布时间：2018-01-30 16:40

本文关键词： 氟苯尼考脊尾白虾药代残留 PKPB模型体内药效学免疫-抗氧酶活耐药性　出处：《上海海洋大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：水产药物残留问题普遍存在,给人类健康和环境带来了很大的危害。进入养殖环境的抗菌药物可引起养殖生物自身和养殖水环境中耐药细菌和耐药基因的产生,破坏生态平衡,威胁水产养殖环境的可持续安全;同时养殖生物体内残留的渔药和某些耐药细菌及耐药基因可通过食物链的传递进入人体,给人类健康带来潜在的威胁。氟苯尼考以其高效、吸收迅速、分布广泛等优点,作为氯霉素替代物,用于近海养殖中,尤其是在虾类养殖及育苗中的广泛使用。然而,由此引起的氟苯尼考残留现象及细菌耐药性不断产生并呈现逐年攀升现象。因此,进行水产品氟苯尼考药残危害和海水源弧菌对氟苯尼考的耐药性监测研究迫在眉睫。脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)是我国新兴的海水养殖品种发展迅速,其作为与鱼蟹贝类等混养的重要经济虾类,显示出良好的养殖前景。本课题以脊尾白虾为研究对象,研究了不同温度、不同给药方式下氟苯尼考在脊尾白虾体内的药代动力学特征;测定了给药剂量下氟苯尼考在脊尾白虾各组织中的残留规律;以脊尾白虾解剖学参数和氟苯尼考在脊尾白虾体内的药残参数构建了氟苯尼考在脊尾白虾体内残留的PBPK模型,以凡纳滨对虾相关数据进行模型参数优化并进行种间类推;进行了氟苯尼考在脊尾白虾体内的药效和危害评价;检测了三种不同养殖模式虾池中弧菌对氟苯尼考的耐药性水平。本论文研究内容共分为以下六部分:1:不同温度和给药方式下氟苯尼考在脊尾白虾体内的药代动力学比较在水温(22±0.4)℃和(28±0.3)℃条件下,分别以10 mg/(kg·BW)和30mg/(kg·BW)给药剂量经肌注和口服氟苯尼考后,用高效液相色谱(HPLC)法测定了脊尾白虾各组织中氟苯尼考浓度,通过DAS2.0药动学软件对氟苯尼考在脊尾白虾体内的血药浓度进行分析,拟合出药动曲线方程,比较不同水温和给药方式下氟苯尼考在脊尾白虾体内的药动学差异,并给出不同水温条件下的给药方案。结果可知,不同水温条件下健康脊尾白虾肌注给药时,氟苯尼考在脊尾白虾体内均符合零级吸收二室开放模型,动力学方程为:C_(t肌注22℃)=5.362e~(-0.69t)+2.53e~(-0.038t)和C_(t肌注28℃)=12.466e~(-1.569t)+4.417e~(-0.065t);口服给药时,氟苯尼考在脊尾白虾体内均符合一级吸收二室开放模型,动力学方程为:C_(t口服22℃)=5.753e~(-0.191t)+0.704e~(-0.036t)-6.457e~(-1.743t)和C_(t口服28℃)=2.337e~(-0.442t)+3.802e~(-0.061t)-6.139e~(-40.223 t)。在相同的给药方式,不同水温条件下,氟苯尼考在脊尾白虾体内的代谢差异较大:肌注给药方式下,在22℃时氟苯尼考在脊尾白虾血浆中C_(max)(9.44μg/m L)和AUC_(0~t)(75.779 h·mg/L)小于28℃水温(16.79μg/m L和80.81 h·mg/L),且t_(1/2α)(1.004 h)和t_(1/2β)(18.26 h)长于28℃水温(0.442 h和10.648 h);口服给药方式下,表现出相似特征,在22℃时氟苯尼考在脊尾白虾血浆中C_(max)(4.87μg/mg)、AUC_(0~t)(47.795 h·mg/L)和F(21.02%)小于28℃水温(6.99μg/m L、70.288 h·mg/L和28.99%),且t_(max)(1 h)、t_(1/2Kα)(0.398 h)、t_(1/2α)(3.623 h)和t_(1/2β)(19.038 h)长于28℃水温(0.5h、0.017 h、1.569 h和11.358 h)。在相同水温条件,不同给药方式下,氟苯尼考在脊尾白虾体内的代谢差异也较大:在22℃时肌注给药方式下,氟苯尼考在脊尾白虾血浆中C_(max)(9.44μg/m L)和AUC_(0~t)(75.779h·mg/L)大于口服给药(4.87μg/mg和47.795 h·mg/L),且t_(1/2α)(1.004 h)和t_(1/2β)(18.26 h)短于口服给药(3.623 h和19.038 h);在28℃水温不同给药方式下,也表现出相似特征。结果表明:氟苯尼考在脊尾白虾体内吸收迅速,分布较广,但消除缓慢,生物利用度不高。两种给药方式下,肌注给药时氟苯尼考在脊尾白虾体内的吸收、分布和消除速率均快于口服给药;不同水温条件下,28℃时氟苯尼考在脊尾白虾体内的吸收、分布和消除速率快于22℃条件下,且28℃条件下氟苯尼考的生物利用度也较高。实际水产动物养殖过程中生产中氟苯尼考的使用要考虑到水温,本实验建议,28℃水温时,脊尾白虾口服给药剂量为33.67mg/(kg·BW),给药间隔为9.2 h;22℃水温时,脊尾白虾口服给药剂量为25.46 mg/(kg·BW),给药间隔为10.8 h。2:氟苯尼考在脊尾白虾体内的残留消除规律研究在水温(22±0.4)℃条件下,分别以10、20和40 mg/(kg·BW)氟苯尼考给药剂量连续投喂脊尾白虾5 d,分别于最后一次给药后的1、2、3、4、5、7、10、15和20 d随机挑选脊尾白虾取血淋巴、肝胰腺、肠、鳃、肌肉和甲壳组织样品,通过HPLC法测定脊尾白虾各组织中氟苯尼考浓度,研究氟苯尼考在脊尾白虾各组织中的残留消除规律。结果表明:给药结束后第1 d各组织中氟苯尼考的浓度由高到低分别是肝胰腺肠血淋巴肌肉≈鳃甲壳。同时氟苯尼考浓度在各个组织中具有明显的剂量效应,同时其浓度随着时间的延长逐渐减小。三种给药剂量下,氟苯尼考在血淋巴中的消除半衰期最短,在肠中消除半衰期最长,且消除半衰期与给药剂量无关。为满足食品安全准则氟苯尼考的最高残留限量0.1μg/g,本实验条件下推荐氟苯尼考在脊尾白虾养殖中的休药期为7 d以上。3:氟苯尼考在脊尾白虾体内的PBPK模型构建和参数优化校正假设氟苯尼考在脊尾白虾体内以原药形式存在,在肝胰腺中的清除符合一级动力学方程。根据脊尾白虾的生理解剖学参数和第2部分氟苯尼考在脊尾白虾体内残留数据结果,设计了包含肝胰腺、肌肉、鳃、甲壳和其他等5大模块的模型结构,建立了氟苯尼考在脊尾白虾体内残留的PBPK模型,对其进行参数优化校正以及灵敏性分析,比较了模型预测值与实测值的相关性和吻合程度;并尝试将PBPK模型外推至凡纳滨对虾,用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)药残数据验证PBPK模型对药物残留预测的有效性。结果表明:各模块器官容积和肝胰腺清除率参数对模型灵敏性影响最大,PBPK模型拟合的氟苯尼考残留浓度预测值与实测值吻合较好,能够准确反映氟苯尼考在脊尾白虾体内的残留消除情况;同时,PBPK模型外推至凡纳滨对虾时,可以准确地预测氟苯尼考的残留情况。说明本研究构建的氟苯尼考在脊尾白虾体内残留的PBPK模型预测药物残留能力具有较高的可信度,这为我国开展甲壳动物药残预测以及风险评估提供一定的科学依据。4:氟苯尼考在感染副溶血弧菌的脊尾白虾体内的药效学在水温(20±0.5)℃条件下,设立空白对照组(不攻菌不给药)、肝损伤对照组(攻菌不给药)、氟苯尼考低剂量组(10 mg/(kg·BW))、中剂量组(20 mg/(kg·BW))、高剂量组(40 mg/(kg·BW))。给药开始前,肝损伤对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染1次诱发肝胰腺损伤,构建病理模型,空白对照组注射同体积PBS无菌缓冲液。同时空白对照组和肝损伤对照组投喂不含药物的基础饲料,低、中和高剂量组分别连续投喂10 mg/(kg·BW)、20 mg/(kg·BW)和40 mg/(kg·BW)的氟苯尼考药饵5 d,停药后观察一周至12 d。实验过程中记录各组发病情况和死亡率,并于感染后1、3、5和12 d取血淋巴和肝胰腺测定细菌数量的变化情况。于感染后12 h(0.5d),感染后连续给药5 d以及停药观察至12 d从各组随机选取10尾脊尾白虾,对肝胰腺进行外观形态观察和记录,并分别随机取3尾虾的肝胰腺进行病理学镜检。结果显示:感染副溶血弧菌5 d后,空白对照组和肝损伤对照组累计死亡率分别为0和65.01%,表明疾病模型构建成功;而氟苯尼考低剂量组、中剂量组和高剂量组累计死亡率分别为58%、51%和45.35%,各组之间差异显著(P0.05)。直至12 d实验结束时,与肝损伤对照组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组的存活率分别提高了7.01%、14.01%和19.66%,各组之间差异显著(P0.05)。除空白对照组外,实验期间各组血淋巴和肝胰腺中细菌含量呈下降趋势。在第12 d实验结束时,低剂量组、中剂量组和高剂量组中血淋巴和肝胰腺细菌含量分别为1.73×10~2 CFU/ml、0、0和2.81×10~2 CFU/g、1.13×10~2 CFU/g、0,与空白对照组差异不显著(P0.05)。石蜡切片观察发现,各实验组肝小管细胞肿胀、空泡比例和破损程度降低。实验结果表明,氟苯尼考对副溶血弧菌感染的脊尾白虾具有良好的防治作用,可用于防治虾类弧菌性疾病。5:氟苯尼考对脊尾白虾免疫-抗氧化酶活性的影响在水温(20±0.5)℃条件下,设立对照组,氟苯尼考组(10 mg/(kg·BW))、中剂量组(20 mg/(kg·BW))、高剂量组(40 mg/(kg·BW))。低、中和高剂量组分别连续投喂10 mg/(kg·BW)、20 mg/(kg·BW)和40 mg/(kg·BW)的氟苯尼考药饵5 d,对照组投喂基础饲料。于停止投喂药饵后的第3、6、12、24、48、96、168和240 h取血淋巴,测定HEM含量、ACP、AKP、T-SOD、CAT和T-AOC等指标的变化情况。结果显示:10 mg/(kg·BW)组和20 mg/(kg·BW)组HEM含量均在3 h时间点显著高于对照组(P0.05),40 mg/(kg·BW)组在3-48 h时间点显著高于对照组(P0.05);10 mg/(kg·BW)组和20 mg/(kg·BW)组ACP活性在3和6 h时间点显著高于对照组(P0.05),40 mg/(kg·BW)组在3-168 h时间点显著低于其他三组(P0.05);10 mg/(kg·BW)组和20 mg/(kg·BW)组AKP活性在3 h时间点均显著高于对照组(P0.05),6-48 h时间点显著低于对照组(P0.05),40mg/(kg·BW)组在3-48 h时间点显著低于对照组(P0.05);10 mg/(kg·BW)组和20 mg/(kg·BW)组T-SOD活性整体高于对照组,分别在6 h和24 h时间点达到最高值(P0.05),40 mg/(kg·BW)组在24和48 h时间点显著低于对照组(P0.05);三剂量组CAT活性均在3和6 h时间点显著高于对照组(P0.05),之后在12-96 h时间点显著低于对照组(P0.05),于24 h时间点达到最低值(P0.05);三剂量组T-AOC活性均在3-96 h时间点显著低于对照组(P0.05),于48 h时间点达到最低值(P0.05),且出现剂量效应。结果表明:本实验所用氟苯尼考三种剂量对脊尾白虾免疫-抗氧化功能具有一定的影响作用。10 mg/(kg·BW)和20 mg/(kg·BW)氟苯尼考对脊尾白虾免疫-抗氧化酶活力具有一定诱导作用(P0.05),而40mg/(kg·BW)则表现出抑制效应(P0.05)。本研究结果为氟苯尼考在海水养殖实际生产中使用的安全评估提供了科学的数据支持。6:三种不同养殖模式虾池弧菌对氟苯尼考耐药性研究自2016年5月-2016年11月,针对虾类三种不同养殖模式地区:山东日照海辰水产有限公司鱼虾蟹贝混养养殖池塘、山东潍坊新大地水产养殖有限公司工厂化循环水养殖池和山东青岛卓越海洋集团有限公司工厂化换水养殖池的水样进行弧菌的分离纯化培养、鉴定及保存;以药敏纸片法和微量肉汤稀释法对收集的弧菌进行了氟苯尼考的耐药性检测;检测了氟苯尼考耐药相关基因(flo R和cfr基因)和整合子-基因盒的携带情况。结果显示:从日照、潍坊和青岛三地共分离到20种142株弧菌,其中日照地区分离出18种69株、潍坊地区分离出9种56株,青岛地区分离出4种17株。其中以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌株最多,分别为37株和31株,共占分离株总数的47.89%。药敏纸片法和微量肉汤稀释法检测共分离出耐药菌株21株,耐药率为14.79%。日照对氟苯尼考耐药菌株有7株,耐药率为10.14%;潍坊对氟苯尼考耐药菌株有13株,耐药率为23.21%;青岛对氟苯尼考耐药菌株有1株,耐药率5.88%。通过测序分析发现鉴定的142株弧菌中flo R基因阳性菌株共有27株,阳性率为19.01%,其中日照有10株,潍坊15株,青岛2株;142株弧菌均未检测到cfr基因。在表型耐药的21株耐氟苯尼考菌株中有6株含有完整的整合子的保守区,检出率为28.57%,其中菌株R-3(灿烂弧菌Vibrio splendidus)和R-5(嗜环弧菌Vibrio cyclitrophicus)的int1可变区还携带有基因盒,均为arr-3-dfr A27基因盒,阳性率为9.52%。此外,菌株R-17(溶藻弧菌)可检测到ISCR元件可变区携带的dhfr耐药基因盒。结果表明,这三种养殖模式中,鱼虾蟹贝混养池塘养殖模式含有的弧菌种类和数量最多,工厂化循环水养殖模式次之,工厂化换水养殖模式最少;而工厂化循环水养殖模式中弧菌对氟苯尼考的耐药率为最高且包含完整整合子的菌株皆分离于此种养殖模式,鱼虾蟹贝混养池塘养殖模式耐药率次之,工厂化换水养殖模式耐药率最低。本研究结果可为海水养殖环境中氟苯尼考的安全性评估提供理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S948

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