狂犬病病毒磷蛋白调控细胞自噬的分子机制研究
本文关键词： 自噬 RABV N P BECN1 CASP2 信号通路 出处：《浙江大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：自噬是一种进化上保守的细胞内过程,是组织维持稳定和发育必须的,自噬或自噬基因在病毒生命周期中既发挥抗病毒又发挥促病毒的作用。然而,至今还没有RABV与细胞自噬关系的系统性研究。本研究立足基础理论,以小鼠神经瘤细胞N2a为研究对象,探索RABV感染与宿主细胞自噬的关系。采用激光共聚焦,免疫印迹,药物处理,RNA干扰以及免疫共沉淀等方法探索RABV感染对细胞自噬的影响。激光共聚焦检测发现外源性GFP-LC3在HEP-Flury、CVS-11感染的12 h、24 h、36 h、48 h自噬泡均由点状聚集成团,总的内源性LC3在16 h、24 h与RABV的N蛋白有显著共定位,且聚集成大的团块状;同时通过免疫印迹检测发现RABV感染4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h内源性LC3-Ⅱ型也均上调表达,但SQSTM1的变化不明显。同时,我们利用ICR昆明乳鼠进行体内攻毒感染实验,经免疫印迹检测发现病毒感染鼠脑内源性LC3-Ⅱ具有显著差异,而SQSTM1水平没有差异变化。除此之外,我们进一步通过激光共聚焦检测发现病毒感染导致自噬泡和溶酶体不融合。为了阐释自噬对RABV感染的影响,免疫印迹检测发现自噬激活剂EBSS/Rapa和抑制剂wortmannin/3-MA以及shRNA处理后,自噬增强有利于病毒转录,蛋白翻译以及病毒释放水平,而抑制自噬则降低了相应的水平。这些结果表明,RABV利用诱导的不完全自噬在宿主细胞中进行病毒自身的复制。为了阐明RABV诱导的不完全自噬反应是否是由病毒蛋白引起的,我们对RABV各个结构蛋白对自噬的影响进行分析。我们在N2a细胞中转染表达病毒蛋白的质粒Flag-N/P/M/G/L,通过激光共聚焦检测发现只有病毒N/P蛋白能诱发外源性GFP-LC3的大的团块状聚集,同时发现N/P蛋白能够增强总的内源性LC3的表达。进一步通过免疫印迹检测发现内源性的LC3-Ⅱ水平均显著上调,而SQSTM1水平没有显著变化。同样地,为了验证病毒感染抑制自噬泡和溶酶体的融合,是否是由某种病毒蛋白引起的,我们共转染GFP-LC3和Flag-N/P,激光共聚焦检测发现病毒N/P均抑制了自噬泡和溶酶体融合。为了进一步检测P蛋白对自噬的影响,免疫印迹结果发现P蛋白N端1-222位氨基酸是诱导不完全自噬的关键区域。这些结果表明,N/P蛋白是诱发不完全自噬的关键蛋白。为了进一步阐明RABV诱发不完全自噬的信号通路机制,我们利用遗传干扰手段,通过免疫印迹和激光共聚焦技术探索RABV感染诱导不完全自噬形成的机制。结果发现,RABV感染抑制CASP2的表达,并激活AKT和MTOR磷酸化水平,同时也激活下游AMPK,ERK1/2,P38磷酸化水平。敲低AKT-MTOR、AMPK、MAPK信号通路元件,过表达CASP2,发现CASP2作为这些通路的上游分子元件介导AMPK-MAPK/AKT-MTOR级联信号通路,从而诱导了不完全自噬反应。同时通过免疫印迹检测发现N、P蛋白能够激活CASP2介导的信号通路,而且免疫共沉淀实验检测发现P蛋白能够和BECN1互作。为了进一步验证BECN1-P蛋白互作是否诱导CASP2依赖信号通路,免疫印迹检测发现敲低BECN1联合转染P蛋白或病毒感染情况下显著抑制CASP2依赖的信号通路。这些结果表明BECN1结合P蛋白介导CASP2依赖的信号通路。综上所述,我们综合利用细胞生物学,免疫学,分子生物学,生物化学等多种手段对RABV感染诱导不完全自噬的分子机制进行深入研究,结果表明,RABV感染诱发的不完全自噬是经P蛋白和BECN1结合导致CASP2介导的级联信号通路参与激活AMPK-MAPK/AKT-MTOR,从而有利于RABV的复制,为进一步研究RABV感染特性以及致病机制提供新的理论基础。
[Abstract]:In order to elucidate the effect of autophagy on RABV infection , the effect of RABV infection on the autophagy of the host cells was investigated . In order to further clarify the mechanism of RABV - induced incomplete autophagy , it was found that N / P protein was the key protein to induce incomplete autophagy .
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
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，本文编号：1511013
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