华山新麦草对小麦黄矮病抗性研究及BYDV-GAV侵染性克隆构建

发布时间：2018-02-16 05:44

  本文关键词： 大麦黄矮病毒GAV 华山新麦草 抗病性 遗传多样性 侵染性cDNA克隆　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)是黄症病毒科(Luteoviridae)多种病毒的统称,仅由麦蚜以持久、循回、非增殖方式传播。大麦黄矮病毒GAV(BYDV-GAV)为我国特有的一种大麦黄矮病毒,近年来已经成为我国小麦黄矮病的主要病原,在小麦生产上造成严重的产量损失。培育和种植抗病品种是防治小麦黄矮病最为经济有效的措施,但是目前大面积推广应用的小麦品种大多对小麦黄矮病缺乏抗性,抗黄矮病小麦品种数量较少,抗病基因来源也较为单一,挖掘新的抗性资源是防治小麦黄矮病研究中亟待解决的重大问题。与此同时,对于BYDV-GAV群体遗传结构、病毒基因功能、分子致病机制等方面的研究也还较少。因此,本研究针对BYDV-GAV引起的小麦黄矮病,分别从寄主抗性和病原致病性两个方面进行了研究,主要结果如下:1.通过室内蚜虫接种,明确了BYDV-GAV能够侵染我国特有的小麦野生近缘植物—华山新麦草(Psathyrostachys huashanica),并且病毒能够通过无毒蚜虫由华山新麦草回传至健康小麦。华山新麦草接种BYDV-GAV后,利用RT-PCR和TAS-ELISA方法分别对接种叶和非接种叶定期进行病毒检测,结果表明BYDV-GAV在华山新麦草接种叶内增殖缓慢,病毒含量极低,且系统运动受到抑制,说明华山新麦草对BYDV-GAV具有高度抗性。对31份小麦-华山新麦草衍生系对BYDV-GAV的抗性进行了鉴定,室内抗病性鉴定和连续三年的田间抗病性鉴定结果表明,小麦-华山新麦草衍生系H9020、H9020-1-6-8-3、H9020-17-25-6-4、H9014-27-1-1-13-5-5、H9020-17-5和H9014-157-2-15-3共6个材料室内接种BYDV-GAV后21 d病毒含量相对于衍生系所用的母本材料普通小麦7182明显降低,H9020、H9020-1-6-8-3、H9020-17-25-6-4和H9015-17-4-4共4个材料田间接种BYDV-GAV后相对于普通小麦7182,症状明显减轻,田间接种病毒对千粒重的影响也较小,表明部分小麦-华山新麦草衍生系对BYDV-GAV有一定抗性,华山新麦草对BYDV-GAV的抗性具有潜力应用到小麦遗传育种工作之中。2.采用RT-PCR分段扩增和cDNA的RACE扩增技术,构建了BYDV-GAV全基因组扩增体系,测定了我国西北冬麦区5个BYDV-GAV小麦分离物的全基因组序列,分别为GAV-AK2(KF523378)、GAV-WN5(KF523379)、GAV-YL4(KF523380)、GAV-FF1(KF523381)和GAV-TS1(KF523382),并结合GenBank数据库中已公布的全部9个BYDV-GAV分离物的全基因组序列进行序列分析。结果表明BYDV-GAV的基因组序列较为保守,基因组核酸序列一致性高达97.0%-99.7%,在基因组内部各个ORF间,ORF1变异最大,ORF4最为保守;基于全基因组序列和RdRp基因(ORF1+2)序列的系统发育分析显示BYDV-GAV种内分为2个类群,但与其地理分布没有相关性,基于RTP基因(ORF3/4+5)、P6基因(ORF6)、P3a基因(ORF3a)的系统发育分析则未见存在种内分化;BYDV-GAV各ORF的核酸变异对其蛋白序列的影响较小,目前病毒种群在进化中处于负向选择压力下,种群遗传结构趋于稳定,种群规模处于扩张阶段;BYDV-GAV种群内部存在着重组现象,检测到GAV-05WN7和GAV-WN5两个分离物可能均由GAV-04FX1和GAV-38W重组而来。3.应用重叠延伸PCR和多片段同源重组技术得到了BYDV-GAV杨凌分离物(GAV-YL4)的全长cDNA,在其3’末端融合了具有自剪切活性的HDV-RZ元件,构建了CaMV 35S启动子介导的侵染性克隆载体pCass-GAV、pCass-GAV-RZ和pCass-HH-G-RZ,构建了玉米泛素启动子介导的pTCK-GAV-RZ和水稻蔗糖合酶1启动子介导的pRSS-GAV-RZ。利用农杆菌GV3101浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana),pCass-GAV-RZ和pCass-HH-G-RZ成功在接种叶转录出能进行自我复制的病毒基因组RNA,并检测到了病毒蛋白的表达,但是子代病毒不能系统运动。在本氏烟上研究发现,BYDV-GAV基因组RNA 3’末端冗余序列能严重干扰病毒基因组RNA的复制或蛋白表达,但5’末端少量的冗余碱基和5’帽子结构对病毒RNA复制和蛋白表达未见明显影响。利用农杆菌LBA4404浸润接种小麦、燕麦,pTCK-GAV-RZ和pRSS-GAV-RZ均能在接种叶转录出少量的病毒基因组RNA,并能检测到病毒复制,但子代病毒仍然缺乏系统运动能力。为了提高农杆菌在单子叶植株上的侵染效率,尝试了不同寄主(小麦、燕麦、水稻)、不同农杆菌菌株(LBA4404、GV3101、AGL1、C58C1)、不同启动子(玉米泛素启动子、RSS1启动子)、不同接种方式(农杆菌浸润接种、农杆菌真空渗透接种、农杆菌针刺接种、基因枪接种),但接种效果未见明显改善。
[Abstract]:Barley yellow dwarf virus ( BYDV - GAV ) is the main pathogen of wheat yellow dwarf disease in China . The results show that BYDV - GAV is the main pathogen of wheat yellow dwarf disease in China . The whole genome sequence of 5 BYDV - GAV wheat isolates in Northwest China was determined by sequence analysis of GAV - AK2 ( KF523378 , KF523379 , KF523379 ) , GAV - YL4 ( KF523380 ) , GAV - FF1 ( KF523381 ) and GAV - 1 ( KF523382 ) . Different promoters ( maize ubiquitin promoter , Rss1 promoter ) , different inoculation methods ( Agrobacterium infiltration inoculation , Agrobacterium vacuum infiltration inoculation , Agrobacterium needle inoculation , gene gun inoculation ) , but the inoculation effect was not improved significantly .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.12
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本文编号：1514793