配子冷冻对小鼠体外受精早期胚胎DNA甲基化模式的影响
发布时间:2018-02-26 01:17
本文关键词: 小鼠卵母细胞 精子 早期胚胎 DNA去甲基化 玻璃化冷冻 出处:《中国农业大学》2016年博士论文 论文类型:学位论文
【摘要】:本研究旨在探讨小鼠配子(精子和卵母细胞)的冷冻保存对于体外受精后早期胚胎发育期间DNA甲基化模式的影响。首先,新鲜和冷冻精子受精后合子的原核发育和早期胚胎的发育过程监测结果显示,冷冻精子的受精率显著低于新鲜精子(P0.01)且原核发育的进程明显延迟(P0.05),获得早期胚胎的卵裂率和囊胚形成率也显著下降(P0.05)。各阶段合子的全基因组甲基化水平检测结果显示,冷冻精子获得的合子在发育晚期DNA相对甲基化水平显著高于新鲜精子(P0.05)。此外,Tet3的mRNA相对表达量检测结果表明,冷冻精子获得的合子中Tet3的mRNA相对表达量比新鲜精子有显著的降低(P0.01)。其次,实验采用免疫荧光染色对新鲜和玻璃化冷冻卵母细胞及其早期胚胎中三种DNA甲基转移酶的表达与分布检测发现,冷冻卵母细胞及其早期胚胎中三种DNA甲基转移酶均出现了不同程度的表达异常。采用实时荧光定量PCR对三种DNA甲基转移酶的mRNA表达水平检测显示,在冷冻卵母细胞中三种DNA甲基转移酶的mRNA相对表达量均显著下降,而在囊胚阶段Dnmt3b的相对表达量仍然很低(P0.05)。最后,实验采用重亚硫酸盐测序对新鲜和玻璃化冷冻卵母细胞及其早期胚胎中四个与DNA去甲基化相关的重要基因Dnmtl、Tet3、Dppa3和Sall4的启动子区甲基化状态进行检测,并使用实时荧光定量PCR对四个基因的mRNA表达水平进行检测。其中,玻璃化组在卵母细胞、合子、2-细胞和囊胚阶段的Tet3启动子区甲基化水平都比新鲜组上升了10%以上,高甲基化克隆的比例在卵母细胞和囊胚阶段也均比新鲜组有显著的升高(P0.05)。相应地,玻璃化组在卵母细胞和早期胚胎中Tet3的mRNA相对表达量都出现了显著的下降(P0.05)。玻璃化组在卵母细胞阶段的Dnmtl启动子区甲基化水平比新鲜组降低了10%以上,但在早期胚胎中仅出现了小幅变化。与之不同,玻璃化组在卵母细胞中Dnmt1的mRNA相对表达量也呈显著下降(P0.05),但在早期胚胎阶段与新鲜组无显著差异。此外,两组间Dppa3和Sal4的启动子区始终维持低甲基化状态,mRNA相对表达量也未受到玻璃化冷冻的影响。综上所述,精子冷冻干扰了合子父源基因组内TET3调控的DNA去甲基化进程,从而导致了受精后合子的原核发育延迟,这会对随后的早期胚胎发育产生不利影响。而玻璃化冷冻会引起卵母细胞中DNA甲基转移酶表达模式的异常,这可能是导致早期胚胎发育过程中DNA甲基化异常的重要原因之一。而卵母细胞玻璃化冷冻引起的合子期DNA去甲基化异常可能主要是由Tet3和Dnmt1启动子区甲基化异常和随后的mRNA表达受损导致的。
[Abstract]:The results showed that the relative expression of Tet3 mRNA in frozen oocytes was significantly lower than that in fresh sperm ( P0.05 ) .
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S814.8
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 ;Epigenetic reprogramming of embryos derived from sperm frozen at-20℃[J];Science China(Life Sciences);2012年04期
,本文编号:1535933
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