基于家系构建及转录组与蛋白质组联合分析青虾生长特性及其调控机制

发布时间：2018-03-01 21:04

本文关键词： 青虾家系构建生长特性小RNA 蛋白质组学关联分析生长调控网络　出处：《山东农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：青虾是长臂虾科中有重要经济价值的品种,其天然产量低,人工繁育难度很大,水产养殖中常缺乏规格整齐的优质速生青虾苗。不能规模化繁殖苗种供应市场需求成为青虾人工养殖的限制因素之一,而传统采用捕捞已抱卵野生雌虾在土塘中自然繁殖的育苗方式,获得的虾苗品质和产量较低。为了标准化培育优质青虾苗,进一步提高青虾产量,深入研究其调控生长的分子机理,本研究从青虾生长特性入手,以构建的全同胞家系为实验材料,排除生长过程中环境因素对生长产生的影响,从组织学角度、核酸水平的转录组学及小RNA组学,进而从蛋白水平的蛋白质组质谱分析,最后将各组学进行联合分析,由表及里的逐层对生长差异进行分析,挖掘生长相关miRNA,最终获得青虾生长相关的主要调控网络,为进一步培育青虾高产速生新品系提供参考。主要研究内容和结果如下:(1)采用在水族箱中模拟青虾全人工繁育的仿生态系统,成功构建了全同胞家系,为室内标准化育苗构建青虾家系用于后续的选择育种提供了技术参考。(2)发现了与青虾具亲缘关系的长臂虾科一个未命名新种,暂定名为弥河虾,并对其家系构建进行了初步研究,结果表明,弥河虾具备优良生长特性,有望成为青虾杂交改良的亲本之一。选用70日龄的相同饲养条件下,且处于蜕壳间期的青虾全同胞家系,以体长差异分为2组,FG组为生长快速者,SG组为生长慢速者,进行如下研究:(3)组织学研究:以成年雄虾和抱卵雌虾的肝胰腺做参照,肝胰腺石蜡切片结果表明,FG组的肝胰腺细胞比SG组分化更快更完善,而SG组结缔组织和胚性细胞较多,反映出两组在营养摄入及消化效率中的差异,推测FG组代谢更旺盛;同时,腹部肌肉的石蜡切片结果表明,FG组腹部肌肉横切面的肌纤维直径各参数均比SG组长,表明FG组的腹部肌肉生长速度更快。(4)转录组研究:以整只虾提取总RNA,进行基于High-seq 4000平台的无参考基因组转录组测序以及基于High-seq 2500平台的小RNA测序,对差异表达基因与差异miRNA分别进行筛选、GO富集及KEGG通路分析,预测了DEM的靶基因,并对差异表达基因DEG与差异表达小RNA即DEM进行关联分析,进而采用q RT-PCR方法对差异表达基因与miRNA相对表达量进行了验证。(1)无参考基因组转录组测序:FG组获得22792166条clean reads,占总reads 97.33%;SG组获得22534835条clean reads,占总reads 97.32%。在FG组与SG组中,共检测到2739个基因显著差异表达。以SG组为参照,FG组中有2116个基因表达显著上调,有623个基因表达显著下调。选取15个差异表达基因对高通量测序结果进行q RT-PCR验证,结果与转录组测序结果基本一致,两者具有很强的相关性(R2=0.901)。(2)小RNA测序:在两组中共检测到592个差异表达的miRNA(含新发现的miRNA),其中有457个miRNA在两个样品中共同表达,有68个仅在FG组中表达,有67个仅在SG组中表达。另外,发现了84个差异表达的新miRNA,有15个新miRNA仅在FG组中表达,有18个新miRNA仅在SG组中表达。选取11个miRNA进行q RT-PCR验证,结果与高通量测序结果基本一致,相关系数为R2=0.972。(3)转录组与小RNA测序的关联分析:关联到14个主要的差异miRNA(上调表达5个、下调表达9个,包含2个全新的miRNA序列novel_22和novel_51),5个上调miRNA对45个下调差异表达基因具有调控作用,9个下调miRNA对137个上调差异表达基因具有调控作用。(5)蛋白组研究:为了从蛋白水平检验基因的转录后表达差异,取用同家系同批次青虾,采用Velos Pro离子阱与高场Orbitrap技术相结合的Thermo Scientific Orbitrap Elite组合式质谱仪,对FG组与SG组的总蛋白酶解肽段,做质谱分析,质谱信息以转录组测序数据预测出的氨基酸库为比对库进行搜库注释,以Max fold change≥2与Anova p-value≤0.05为限制筛选条件,筛选到生长快速组有8个蛋白表达比慢速组显著升高,有104个蛋白表达比慢速组显著降低。转录组、小RNA与蛋白质组的联合分析,获得了调控青虾生长的3条调控网络。联合分析结果表明:青虾全同胞家系的生长差异是由于快慢两组间基因转录效率的差异以及由酶类催化的代谢差异造成的,该过程受相关miRNA的调控。获得的3条青虾生长相关基因调控网络模式为:网络模式1:由sha-miR-21调控靶基因CFL,作用于肌动蛋白解聚因子(cofilin/actin-depolymerizing factor)的表达,推测其在青虾肌肉发育中起正调控作用。网络模式2:由sha-miR-21和hsa-miR-21-5p共同调控靶基因MCCC1的同源基因,影响β-甲基丁烯酰辅酶A羧化酶(methylcrotonoyl-Co A carboxylase)的表达,调控缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径,推测其在青虾生长中对氨基酸的利用速率中起主要的正调控作用,促进青虾生长。网络模式3:由新的miRNA成员novel_22调控靶基因Tspst的同源基因,作用于蛋白酶体β7亚基(proteasome subunit beta type-7),调控泛素蛋白酶体途径,推测其在青虾生长中对蛋白降解速率起主要调控作用,其蛋白表达下调时,利于同化作用,正调控青虾生长。sha-miR-21同时调控网络模式1和网络模式2,形成由氨基酸代谢关联肌肉生长的网络,在全同胞家系的生长中起重要作用。总之,本研究成功构建了青虾全同胞家系,从组织学角度及m RNA、miRNA和蛋白质组学角度,系统研究了排除环境影响后,青虾全同胞家系生长差异的分子生物学机理,获得了3条调控青虾生长的网络,为培育青虾速生家系提供重要参考。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

【参考文献】