新城疫病毒HN蛋白纳米抗体的筛选及功能研究

发布时间：2018-03-01 23:13

本文关键词： 新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白纳米抗体酵母双杂交　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种严重危害鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病。自1926年首次报道以来,ND在全球范围内已发生四次大流行,给各国养禽业造成了巨大的经济损失,同时也严重威胁着野生鸟类健康,是影响养禽业最主要疫病之一,被国际兽医局(Office International Des Epizooties,OIE)列为必须通报的动物疫病。过去几十年,由于世界各国采取了严格的疫苗免疫措施,使ND的大规模流行得到了有效控制,然而免疫鸡群发生ND的情况仍然存在,并且不断从免疫鸡群中分离到致病性NDV,同时研究表明现有疫苗和治疗性生物制品并不能完全阻止ND的传播,因此很有必要尝试开发新的产品以用于ND的防控。20世纪90年代后期,Hamers等在骆驼科和鲨鱼科动物体内首次报道了重链抗体的存在,克隆其具有抗原结合能力的可变区后即为VHH(Variable domain of camelid heavy-chain antibody)。由于VHH为单域结构,分子量仅为常规抗体的1/10,且大小在纳米级,因此又被称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。分析重链抗体重链可变区后发现,相比常规抗体而言,VHH抗体FR2区(Framework regions,FR)37、44、45和47位发生亲水性氨基酸替换,CDR1(Complement determine region,CDR)和CDR3区存在额外半胱氨酸残基,且CDR3区较常规抗体CDR3区要长。上述结构特点使纳米抗体具有分子量小、结构稳定、亲和力高、不易聚集、可识别常规抗体不能识别的结构和一些隐蔽表位等优点。因此,纳米抗体是病毒性疾病诊断和治疗的理想分子,但目前尚未见有关抗NDV纳米抗体的报道。本研究为了获得抗NDV的纳米抗体,首先构建了NDV免疫纳米抗体酵母双杂交文库,并对文库质量进行了评价;以截短的NDV HN蛋白为靶标,构建p GBKT7-HN诱饵质粒,对纳米抗体酵母双杂交文库进行筛选,并将筛选出的纳米抗体表达纯化后进行活性鉴定;同时构建了二聚化纳米抗体,比较了二聚化纳米抗体和单体纳米抗体的反应活性;最后构建了稳定表达纳米抗体的DF-1细胞系,探究了稳定表达纳米抗体对NDV增殖的影响。主要内容如下:(1)利用新城疫(La Sota株)和H9禽流感(F株)二联灭活疫苗参照骆驼与成年鸡体重比对6月龄雌性双峰驼进行5次免疫,免疫后通过HI试验监测双峰驼体液免疫应答水平,当抗体水平最高时采集外周血,分离外周血淋巴细胞。以分离的外周血淋巴细胞为起始材料,抽提总RNA,通过巢式PCR扩增编码VHH的基因序列。将带有同源臂的VHH PCR产物与线性化的p GADT7-Rec质粒共转Y187酵母感受态细胞,通过在酵母细胞内同源重组来构建纳米抗体酵母双杂交文库。经测定,构建的文库库容为1.25×107,滴度为3.45×108cfu/m L,文库插入效率为96%;随机挑取10个PCR阳性的克隆做测序比对,结果显示均为VHH抗体序列,且序列各不相同,表明文库多样性良好。(2)以NDV HN蛋白编码基因为模板,PCR扩增得到截掉跨膜区的HN基因序列(49-577位氨基酸),克隆至p GBKT7载体上构建诱饵质粒p GBKT7-HN。诱饵质粒转化Y2H Gold酵母感受态细胞后,进行自激活能力和毒性验证,结果表明此诱饵菌无自激活活性和毒性。以此诱饵菌与文库菌进行杂交来筛选抗HN蛋白的纳米抗体,筛选到的阳性克隆进行文库质粒拯救,拯救的阳性质粒与诱饵质粒再次共转Y2H Gold感受态细胞进行确证,最后对确认的真阳性质粒进行序列测定和比对分析,最终成功获得7株阳性克隆。(3)将获得的7株抗体序列克隆至原核表达载体p HSIE上,构建纳米抗体原核表达质粒p HSIE-VHH;转化Rosetta感受态细胞进行诱导表达,并优化表达条件,发现纳米抗体在IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导6 h时表达量最佳;按照优化的最佳表达条件进行大量诱导表达后,参照Clontech公司的Talon Metal Affinity Resin树脂说明书纯化重组蛋白,并优化了纯化时的洗脱条件,获得了杂带少、条带单一的VHH抗体。同时为鉴定纯化的VHH抗体与NDV和HN蛋白的反应活性,本研究进行了血凝抑制试验(Haemagglutination inhibition assay,HI)、间接ELISA、斑点杂交、Pull down、免疫细胞化学试验和细胞中和试验。HI试验结果显示,7株VHH抗体可不同程度抑制多种NDV毒株的血凝活性,但HI滴度均显著低于阳性血清对照(P0.05)。间接ELISA结果表明,VHH抗体均可与NDV反应,其OD450值显著高于阴性对照(P0.05),且VHH3、VHH4、VHH5、VHH6和VHH7的反应性高于阳性对照。斑点杂交结果显示,VHH抗体可识别非变性的NDV病毒粒子。Pull down试验进一步证明VHH抗体可与HN蛋白反应。细胞免疫化学试验结果显示,VHH抗体还可识别被病毒感染的DF-1细胞内的NDV抗原。最后,细胞中和试验发现部分VHH抗体可在感染早期干扰病毒的复制。(4)为改善VHH抗体的反应性和中和活性,利用一段linker通过Overlap PCR将2个VHH单体进行串联后克隆至表达载体p HSIE上,构建了二聚化VHH抗体表达载体p HSIE-Dim VHH。将p HSIE-Dim VHH转化Rosetta感受态细胞后,进行了二聚化抗体的诱导表达,并优化了表达条件,结果发现二聚化VHH抗体在IPTG终浓度为0.4mmol/L,诱导12 h后表达量最佳。根据Talon树脂(Clontech)操作说明纯化了二聚化VHH抗体,并优化了纯化条件,最终获得了较纯的二聚化VHH抗体。间接ELISA和中和试验结果显示,二聚化VHH抗体的ELISA反应活性高于单价VHH抗体,但中和活性并无改善。(5)为了探究VHH抗体在细胞内的抗病毒活性,本章构建了纳米抗体慢病毒表达载体,与包装辅助质粒共转染293T细胞后,拯救出了慢病毒,再通过慢病毒转导的方式将VHH抗体导入DF-1细胞中,经过嘌呤霉素筛选后获得了稳定表达VHH抗体的细胞系,并在稳定表达VHH的细胞系对NDV增殖情况进行了探究,发现稳定表达VHH的可抑制NDV的增殖。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【参考文献】