TALENs介导的人α-乳白蛋白基因定点敲入β-乳球蛋白位点奶山羊生产

发布时间：2018-03-06 10:14

  本文选题：山羊乳汁　切入点：?-乳球蛋白　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：山羊乳汁及其乳产品如酸奶、奶酪和奶粉等在很大程度上满足了人类的营养需求。在医疗方面,对牛奶有过敏反应及胃肠道消化功能紊乱的人更适于饮用羊奶。然而,虽然山羊乳汁能为人类提供丰富的营养,但同时也可引发很多人尤其是婴幼儿的过敏反应。山羊乳汁中的一种主要的乳蛋白过敏原是?-乳球蛋白(?-lactoglobulin,BLG),它是山羊乳清蛋白的主要成分,占乳清总蛋白的53.7%左右。然而人的乳汁中不存在BLG,山羊乳汁BLG如同牛乳汁BLG一样被认为是引起婴幼儿乳过敏症的主要过敏原。人?-乳白蛋白(human?-lactalbumin,hLA)是人乳汁中一种主要的乳清蛋白质,占人乳总蛋白的28%左右,含有丰富的色氨酸及半胱氨酸。hLA能够促进乳汁产量相关因子即乳糖的合成,通过增加乳糖成分来提高乳汁产量。因hLA含有丰富的与大脑发育相关的氨基酸成分而具有促进婴幼儿大脑发育,调节食欲,睡眠等功能。研究表明,hLA还能诱导肿瘤细胞凋亡及有效治疗由人乳头瘤病毒引起的皮肤疣等。近年来,由转录激活样效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)介导的基因打靶技术被应用于转基因动物生产,它能将传统的同源重组技术介导的基因打靶效率提高数个个数量级。本研究构建了靶向山羊BLG基因第一外显子的打靶载体,借助TALENs这种基因编辑工具,利用同源重组手段将人?-乳白蛋白基因定点插入到山羊BLG基因位点,以期在达到敲除山羊BLG基因的同时利用BLG基因的内源性启动子启动hLA基因的转录和翻译,从而为生产低敏性山羊乳或人源化山羊乳奠定基础。本研究内容主要分为以下几个部分:1.针对TALENs在山羊BLG基因第一外显子的切割位点,制备了靶向山羊BLG基因位点的基因打靶载体ploxpII-hLA-neo。此打靶载体以ploxpII为骨架载体,含有两个同源臂大小分别为738 bp和714 bp左右的5’arm和3‘arm,两同源臂间为hLA和新霉素抗性基因序列(nemycine resistant gene,neo),同时neo两端含有两个同向的Loxp序列。2.为验证hLA基因能否在内源性BLG基因启动子的调控下启动表达并分泌到细胞外,本研究将构建的含hLA的打靶载体ploxpII-hLA-puro和TALEN质粒对共转染山羊乳腺上皮细胞。首先通过药物筛选得到细胞克隆,然后用RT-PCR,Western blot等方法检测抗药性细胞克隆及上清。结果发现,山羊乳腺上皮细胞中BLG mRNA水平降低,hLA mRNA有高水平表达,且在细胞培养上清中检测到hLA蛋白的存在。3.将构建的打靶载体ploxpII-hLA-neo和TALEN质粒DNA或mRNA共转染山羊胎儿成纤维和成体成纤维细胞。通过G418药物筛选初步获得抗药性细胞克隆,经junction PCR和Long-range PCR鉴定发现,TALENs DNA介导的同源重组共获得83株阳性基因打靶细胞克隆,其中BLG单等位基因和双等位基因突变细胞克隆效率分别为10.1%和1.1%;TALENs mRNA介导的同源重组共获得86株基因打靶细胞克隆,其中BLG基因突变细胞克隆效率为8.4%,低于TALEN质粒DNA介导的外源基因整合效率。4.将BLG单等位基因和双等位基因突变细胞克隆作为核供体细胞进行体细胞核移植。将每株克隆的早期卵裂重构胚进行体外培养并做PCR检测,排除了混有非基因打靶细胞的细胞克隆。最后选取5株细胞活力较好且核型正常的基因打靶细胞克隆作为供体细胞生产体细胞克隆动物。将早期卵裂的重组胚胎共717枚(2-4细胞)移植到50只同期发情的受体山羊输卵管中,60 d的妊娠率约为34%。妊娠足月共获得6只体细胞克隆奶山羊,经PCR和Southern blot鉴定发现,其中1只为BLG双等位基因修饰奶山羊,其余5只为BLG单等位基因修饰奶山羊。5.为分析基因打靶奶山羊乳汁成分及hLA的表达,将5只青年期BLG单等位基因修饰奶山羊与野生型公山羊配种。妊娠结束后,采集转基因奶山羊乳汁,分离乳汁中乳清蛋白成分。经蛋白质电泳及考马斯亮蓝染色发现,基因打靶奶山羊乳汁中BLG含量减少,?-lactalbumin成分升高;经Western blot分析发现,hLA在基因打靶奶山羊乳汁中获得高表达;经ELISA分析,hLA在基因打靶奶山羊乳汁中的含量最高达1.2 mg/mL。通过对山羊乳汁中蛋白质,乳糖,脂肪和乳固形物分析发现,转基因奶山羊乳汁成分与野生型山羊乳汁成分之间没有显著性差异。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827

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本文编号：1574409