水稻黄绿叶基因YGL8和YGL9的克隆与功能分析

发布时间：2018-03-09 00:26

本文选题：水稻　切入点：黄绿叶基因　出处：《西南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是世界上极其重要的粮食作物之一,同时也是单子叶植物研究的重要模式植物。水稻主要通过叶片中的叶绿体进行光合作用,合成碳水化合物并将其贮藏于稻谷中。叶色突变是植物中普遍存在的一种现象,一般来说,叶色突变体都涉及到光合色素含量的变化,因而直接体现在叶片颜色的变化上。光合色素的主要功能就是吸收光能和传递电子,因此,其在光合生物的光合过程中扮演着关键角色。大量的研究结果显示,叶色突变体是研究植物光合色素代谢、叶绿体结构功能、叶绿体发育、光合作用以及光形态建成的理想材料。本研究利用了经EMS(ethyl methane sulfonate)诱变籼稻恢复系缙恢10所产生的两个黄绿叶突变体,克隆了两个水稻黄绿叶基因YGL8和YGL9,并对其进行了功能互补验证,同时,对这两个基因的器官特性表达情况以及相关基因的表达情况进行了分析,也对这两个基因所编码的蛋白的结构和功能等进行了分析,主要研究结果如下:1、水稻黄绿叶基因YGL9:(1)YGL9基因的克隆水稻ygl9突变体在整个生育期均表现为黄绿叶表型,但随着植株的生长,叶片颜色少量加深。DNA和c DNA测序发现,ygl9突变体的LOC_Os03g03990基因的第900个碱基由G突变为A,使第300个氨基酸由色氨酸(TGG)突变为终止密码子(TGA),导致翻译的提前终止。LOC_Os03g03990编码了可能的水稻叶绿体信号识别颗粒43 k Da蛋白(cp SRP43)。我们初步将其确定为YGL9的候选基因。(2)YGL9基因的功能互补验证为了确认是否是LOC_Os03g03990的突变导致了ygl9突变体的黄绿叶表型,我们克隆了包含LOC_Os03g03990在内的6812 bp野生型基因组序列(包括4373bp的编码区上游序列、1167 bp的编码区序列和1272 bp的编码区下游序列)构建功能互补载体并转化ygl9突变体愈伤组织,阳性转化植株的叶片全部恢复了正常绿色且其叶绿素和类胡萝卜素含量也达到野生型水平。这些结果证明,LOC_Os03g03990基因就是YGL9基因。(3)YGL9蛋白结构分析系统进化树显示,YGL9属于光合生物所特有的cp SRP43蛋白家族。亚细胞定位结果表明,YGL9位于叶绿体。氨基酸序列比对结果显示,YGL9与拟南芥的cp SRP43的序列高度相似,其成熟蛋白可能也包含了3个CD(CD1-3)结构域和4个Ank(Ank1-4)结构域,这些结构域可能介导了蛋白与蛋白之间的相互作用。(4)YGL9基因的器官特异表达分析及相关基因的表达分析用实时定量PCR(realtime quantitative PCR,q RT-PCR)检测了YGL9的器官特异表达情况,结果显示,YGL9在绿色叶鞘和剑叶中的表达量较高,而在根、茎、白色幼穗和绿色幼穗中表达量较低。q RT-PCR结果显示,在分蘖期,相比于野生型,ygl9突变体的部分叶绿素合成途径相关酶基因的转录水平不同程度地下调,所检测的类胡萝卜素合成途径相关酶基因也不同程度地下调,部分捕光叶绿素a/b结合蛋白(light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein,LHCP)编码基因也不同程度地下调,此外,几乎所有所检测的叶绿体发育和光合相关基因也不同程度地下调;在抽穗期,相比于野生型,ygl9突变体的叶绿素和类胡萝卜素合成途径相关酶基因的转录水平均不同程度地上调,LHCP基因的转录水平达到或超过野生型植株的表达水平,大部分叶绿体发育和光合相关基因的转录水平也达到或超过野生型植株的表达水平,但psa L和ndh A的转录水平仍大幅下调。(5)水稻cp SRP54的预测与分析通过STRING网站预测与YGL9互作的蛋白,得到两个可能的水稻叶绿体信号识别颗粒54 k Da蛋白(cp SRP54)——LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556。测序结果显示,LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556的编码框全长分别为1653bp和1674 bp,均包含15个外显子和14个内含子。序列比对结果显示,LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556前体蛋白的氨基酸序列高度相似。q RT-PCR结果显示,ygl9突变体中LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556的转录水平均明显升高,表明这两个基因均直接或间接受到YGL9突变的影响。亚细胞定位结果表明,LOC_Os11g05552和LOC_Os11g05556均位于叶绿体。系统进化树显示,单子叶植物中存在两类非常相似的LOC_Os11g05552类蛋白和LOC_Os11g05556类蛋白,他们与双子叶植物和绿色藻类的cp SRP54蛋白聚在一起。氨基酸序列比对结果显示,LOC_Os11g05552、LOC_Os11g05556和拟南芥的cp SRP54的序列非常相似,而LOC_Os11g05552的C端具有与拟南芥的cp SRP54的C端一致的APPGTARRKR核心序列,其中的ARR序列是拟南芥的cp SRP54与cp SRP43结合的关键序列,但LOC_Os11g05556不包含这些关键序列。因此,我们认为,LOC_Os11g05552类蛋白才是单子叶植物的cp SRP54蛋白。序列比对结果还显示,LOC_Os11g05552的成熟蛋白也可能包含一段NG-domain和一段M-domain。(6)YGL9与LOC_Os11g05552的酵母双杂交鉴定酵母双杂交结果表明,YGL9与LHCP的L18结构域互作,进一步的实验结果表明,YGL9的Ank1-4结构域与LHCP的L18结构域互作,而YGL9的其他结构域与LHCP的L18结构域均不互作。而YGL9与LOC_Os11g05552的全长成熟蛋白不互作,可能是由于LOC_Os11g05552的NG-domain存在跨膜结构域的缘故。为了排除可能的跨膜结构域的影响,我们将LOC_Os11g05552的M-domain单独与YGL9杂交,结果表明,LOC_Os11g05552的M-domain与YGL9互作,进一步的实验结果表明,YGL9的CD2结构域与LOC_Os11g05552的M-domain互作,而YGL9的其他结构域与LOC_Os11g05552的M-domain均不互作。上述结果表明,YGL9即水稻的cp SRP43,LOC_Os11g05552即水稻的cp SRP54。2、水稻黄绿叶基因YGL8:(1)YGL8基因的克隆水稻ygl8突变体在整个生育期均表现为黄绿叶表型,但随着植株的生长,叶片颜色少量加深。DNA和c DNA测序发现,ygl8突变体的LOC_Os01g73450的第671个碱基由C突变为T,导致第224个氨基酸由丙氨酸(GCT)突变为缬氨酸(GTT)。LOC_Os01g73450编码了一个可能的UMP激酶。我们初步将其确定为YGL8的候选基因。(2)YGL8基因的功能互补验证为了确认是否是LOC_Os01g73450的突变导致了ygl8突变体的黄绿叶表型,我们克隆了包含LOC_Os01g73450在内的6478 bp野生型基因组序列(包括1570bp的编码区上游序列、3844 bp的编码区序列和1054 bp的编码区下游序列)构建功能互补表达载体并转化ygl8突变体愈伤组织,阳性转化植株的叶片恢复了正常绿色且其叶绿素总含量也达到野生型水平。对中花11的LOC_Os01g73450的RNA干涉结果显示,阳性干涉植株均表现为黄绿叶表型,且其LOC_Os01g73450的转录水平大幅下调。这些结果证明,LOC_Os01g73450基因就是YGL8基因。(3)YGL8蛋白结构分析亚细胞定位结果表明,YGL8位于叶绿体。系统进化树显示,与YGL8同源的高等植物的UMP激酶与原核蓝藻菌的UMP激酶聚在一起。氨基酸序列比对结果显示,与YGL8同源的高等植物的UMP激酶与原核生物细菌、蓝藻的UMP激酶均包含非常相似的UMP激酶保守结构域。这些结果表明,高等植物的叶绿体UMP激酶和细菌、蓝藻的UMP激酶可能存在相似的结构和功能。(4)YGL8基因器官特异表达分析及相关基因的表达分析用q RT-PCR检测了YGL8的器官特异表达情况,结果显示,YGL8在叶片中的表达量较高,而在根、茎、叶鞘、幼穗中的表达量较低。q RT-PCR结果显示,在苗期时,与野生型相比,ygl8突变体的部分叶绿素合成途径相关酶基因的转录水平大幅降低。此外,ygl8突变体的PSI的psa A、psa B和PSII的psb C的转录水平大幅下调,而NADH脱氢酶的亚基编码基因ndh B的转录水平大幅上调。这些基因的异常表达可能影响了ygl8突变体的叶绿体发育。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511;Q943.2

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