狂犬病的探索治疗以及相关病毒在神经科学中的应用

发布时间：2018-03-10 05:01

本文选题：狂犬病病毒　切入点：memantine　出处：《华中农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染动物神经系统导致神经活动紊乱的一种人畜共患病,致死率高达100%。狂犬病在全球范围内分布广泛,当前对狂犬病的防控仍不彻底,每年依然有上万例狂犬病患者死亡。目前针对狂犬病防控和治疗的研究主要集中在RABV的疫苗研发、田间防疫、发病机理以及药物控制等方面,但对狂犬病的治疗仍然没有有效的药物和方法。由于狂犬病病毒侵染神经系统导致神经系统的功能紊乱,短时间内严重威胁患者的生命,为了缓解狂犬病毒引起的神经紊乱并为机体免疫系统赢得抵抗狂犬病病毒的宝贵时间,我们利用目前对神经具有保护作用的药物-美金胺(memantine)来开展该药物在缓解狂犬病症状方面的研究,以期为狂犬病的临床治疗提供新的思路和方法。另一方面,由于RABV对神经系统的高度嗜性,是目前最为常用的高效逆行环路示踪病毒之一。基于RABV开发更为有效的环路示踪工具将有助于神经环路结构与功能的研究。因此,我们在已有的RABV反向遗传学系统的基础上对病毒基因组做出改造和修饰,拯救出了有标记和操控功能的且传播缺陷的糖蛋白缺失重组病毒(rRABVΔG),并且用于解析视觉神经环路的精细结构和功能。具体研究内容如下:1.Memantine缓解狂犬病症状的研究药物memantine能够通过血脑屏障,对神经元表面N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA受体)非竞争性可逆结合,对神经元具有保护作用,用于治疗阿尔茨海默症。为了探索该药物能否缓解狂犬病毒造成的神经活动紊乱,我们开展了如下实验:(1)将RABV中强毒株CVS-24感染体外培养的原代神经元,加入memantine后发现其对RABV引起的神经元损伤有一定的保护作用;(2)在小鼠的RABV攻毒实验中,memantine对发病小鼠的治疗作用有限,能微弱地延长发病小鼠生存时间。作为对比,在日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)感染的小鼠实验中,memantine能显著延长小鼠生存时间、降低脑内血管袖套和炎性细胞浸润,对小鼠脑内病毒量也有降低作用。2.利用狂犬示踪病毒(rRABVΔG)解析初级视觉皮层至丘脑环路的精细结构通过反向遗传学操作系统改造rRABV-SAD,敲除糖蛋白(glycoprotein,G)基因并插入多种颜色的荧光蛋白基因,得到多色狂犬示踪病毒。将该病毒注射到小鼠丘脑背外侧核(lateraldorsal of thalamus nucleus,LD)、丘脑后外侧核(lateralposterior of thalamus nudleus,LP)和外侧膝状体背侧核(dorsal part of lateral geniculate nucleus,d LGN)等初级视觉皮层(primary cisual cortex,V1)的投射靶区,逆行标记靶向该区的V1皮层神经元,通过荧光颜色将靶向丘脑特定核团的V1神经元分群,并分析了它们的分布特点;同时我们观察到一些同时投射到丘脑的多个核团的V1皮层神经元即多靶神经元,进一步结合荧光显微光学切片断层成像技术(fluorescence micro-optical sectioning tomography,fMOST),我们对单细胞水平的V1皮层多靶神经元进行了全脑精细成像;为了进一步追踪靶向丘脑特点核团的V1神经元的上游环路,我们在V1皮层感染AAV病毒补充狂犬病毒的G蛋白,使V1神经元内的rRABVΔG逆行跨单级突触标记上游神经元,从而解析了V1-LD、V1-LP和V1-d LGN环路的上游环路,进而对上游神经元的分布和数量进行全脑范围内统计分析,最终得到全面而详细的V1至丘脑环路的精细结构。3.利用改造的嗜神经病毒初步探索V1至丘脑环路的功能结合rRABVΔG病毒示踪技术和在体双光子钙成像技术,我们对V1-丘脑核团的环路进行功能上的探索,主要在树突棘和树突水平分析了靶向丘脑不同核团的V1神经元的自发神经活动特点,从而对比V1-丘脑特定核团投射环路中V1神经元接收上游环路的输入的差异。4.单眼视觉剥夺的病理模型中V1至丘脑环路的结构可塑性在单眼视觉剥夺(monocular deprivation,MD)模型下,结合rRABVΔG病毒示踪、光遗传学和在体光纤记录手段探索V1-丘脑环路的可塑性。通过rRABVΔG-eGFP病毒对MD小鼠对侧丘脑核团逆行标记,发现逆标的V1神经元数量与对照相比显著减少,提示在视觉形成关键期对小鼠单眼视觉剥夺能够引起V1-丘脑投射的减少;进一步通过光遗传学手段刺激V1的神经元,通过光纤检测钙信号技术记录丘脑相关核团神经活动,最终在活体水平对环路的可塑性变化进行功能性验证。我们在memantine缓解狂犬病方面的研究对狂犬病治疗方法的探索有参考意义。同时,我们在利用狂犬病毒示踪工具解析初级视觉皮层至丘脑环路的精细结构与可塑性的研究,将为视觉功能研究提供一定的环路基础,有助于解析视觉信息在皮层与丘脑间的传递与整合,也将有助于补充人们对视觉环路可塑性的认识。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S855.3

【参考文献】