立枯丝核菌内切纤维素酶诱导寄主的防卫反应

发布时间：2018-03-12 10:21

  本文选题：Rhizoctonia　切入点：solani　出处：《山东农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：玉米是我国重要的粮食作物及工业原料。近年来玉米纹枯病已成为玉米生产上的主要病害。该病害优势致病菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn) AG-1-IA融合群。植物细胞均具有细胞壁,且植物的地上部分的表皮还覆盖着角质层。植物病原真菌和细菌都能产生一系列降解角质层和细胞壁的酶,如角质酶、纤维素酶和果胶酶等,这些酶类帮助植物病原真菌和细菌穿透植物细胞壁并在植物体内蔓延。目前,植物病原真菌产生的细胞壁降解酶在真菌与植物互作机制方面引起人们的广泛兴趣和关注。前人的研究发现,在真菌与植物互作过程中,真菌木聚糖酶和果胶酶具有PAMP分子的特点,而纤维素酶一直未受到重视。我们的研究中,以一个R. solani (AG-1-IA) β-1,4-内切纤维素酶EG1为研究对象,对其在与寄主植物互作过程中的作用与机制进行了研究与讨论。EG1含有227个氨基酸,aa1-20为信号肽序列,属于45家族糖苷水解酶。我们通过基因定点突变将氨基酸序列第32位的天冬氨酸(Aspartic acid, Asp)突变为丙氨酸(Alanine, Ala),导致其催化活性的丧失。将EG1的野生型(WT)与突变型(D32A)基因分别插入pPIC9K载体构建酵母表达载体并转化毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115感受态细胞,然后进行诱导表达、纯化和ddH2O透析,获得纯酶,对两者进行了一系列验证与分析,以转化空pPIC9K载体的P. pastoris表达产物作为对照(CK)EG1的野生型WT和突变型D32A在40nM浓度水平可以引起玉米、烟草和拟南芥叶片组织的坏死,同时引起这些植物三个防卫反应标志基因表达水平的上调,包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和病程相关蛋白(PR1α)。对被40nM的WT和D32A侵染3d后的玉米的奇甜蛋白、组胺受体、β-1,3-葡聚糖酶、病原相关蛋白10、交替氧化酶、锌指同源蛋白、几丁质酶、病原相关蛋白4和谷胱甘肽转移酶等十个防卫反应相关基因的荧光实时定量PCR的检测,我们发现,这些基因的表达水平也都存在不同程度的上调。利用烟草悬浮细胞作为处理对象,40nM的WT和D32A可以诱导烟草悬浮细胞活性氧(ROS)的产生、钙离子(Ca2+)的积累、培养介质的碱化和乙烯的生物合成。这些现象与结果均符合PAMP分子的特点,证明EG1确实是一个PAMP分子,同时该PAMP活性与EG1的催化活性相互独立。接着我们采用PVX表达系统实验为我们提供有力的证据。首先通过PCR扩增的方法在EG1的野生型与突变型基因5’末端引入信号肽序列,然后插入pGR106空载构建PVX表达载体,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101感受态细胞。将携带重组质粒的A. Tumefaciens菌液接种烟草叶片,5d可以使烟草叶片产生明显的坏死。用EG1制备多克隆抗体,以抗植物肌动蛋白鼠单克隆抗体作为内参照,对接种5d的叶片提取物进行蛋白质印记分析,我们检测到了EG1条带。同时对接种5d的叶片提取物进行EG1催化活性的检测,显示野生型具有较高的催化活性,而突变型活性极低。这些结果从植物体内的角度证实了EG1是一个PAMP分子。为了找到EG1发挥PAMP活性的结构域,我们对EG1野生型及突变型的6个保守区域进行了突变。其中突变第六个保守区后,WT-M具有较高的催化活力,可以引起植物组织坏死而不能提高植物防卫反应标志基因的表达量；而D32A-M没有催化活力,且既不能引起植物组织的坏死,也不能使植物防卫反应基因过量表达。我们猜测,第六个保守区可能是EG1 PAMP活性的关键区域。为了证实这个猜测,我们又检测了WT-M和D32A-M对烟草悬浮细胞产生ROS的影响,发现两者均不能诱导烟草悬浮细胞活性氧的产生和培养介质的碱化；利用PVX表达系统实验,发现WT-M可以使烟草叶片产生坏死,而D32A-M则不可以。这些结果证实了该保守区(aa172-180,序列为CNWRFDWFQ)即为EG1发挥PAMP活性的关键区域。目前,国内外对于玉米纹枯病的研究主要集中于发病规律和防治措施,但是从分子水平上对R. solani与寄主的互作机制的研究较少。本研究证实了R. solaniβ-1,4-内切纤维素酶EG1是一个PAMP分子,其PAMP活性与催化活性相互独立,同时也确立了其发挥PAMP活性的关键区段。这些研究结果为进一步阐明R. solani与寄主的互作机制提供了理论依据,为玉米纹枯病的有效防治奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.13

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本文编号：1601140