捻转血矛线虫排泄和分泌蛋白（ESP）免疫调节特性的研究

发布时间：2018-03-13 02:33

  本文选题：捻转血矛线虫　切入点：排泄分泌蛋白　出处：《南京农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：捻转血矛线虫病是一种由捻转血矛线虫引起的小反刍动物的高致病性的重要疾病。重度感染动物每日的失血量可达250 mL以上,严重导致动物的产毛量减少、胴体的品质下降、贫血甚至死亡。ESPs是由虫体分泌的一类蛋白分子,其中包括多种蛋白质和糖蛋白,具有降低宿主免疫力的作用,并且可能引发宿主免疫应答和病理反应。山羊对捻转血矛线虫的免疫力的获得与其品种、年龄、和既往感染有关,但是这些免疫现象的机制尚不清楚。在本文研究中,我们鉴定了 ESP在免疫调节中的作用,具体内容如下:1.体外捻转血矛线虫排泄分泌蛋白(HcESPs)对山羊外周单核血细胞(PBMCs)功能的影响将捻转血矛线虫成虫置于37℃,5% C02条件下于RPMI 1640培养基(虫体密度为为100条/ml)中培养。孵育完成后,取上层培养液,经过离心、过滤灭菌、富集、在3-kDa滤器中脱盐(10mMTris,NaClpH7.4)等过程提取蛋白。收集的HcESP经SDS-PAGE检测显示,其条带分布在13 -180 kDa之间,这些条带可以通过Western Blot被检测到。免疫荧光分析证实了 HcESP可以和山羊PBMCs结合。通过PBMCs和HcESP的共孵育的研究,我们发现了 HcESP在细胞因子产生、细胞增殖、细胞迁移、NO产生和细胞凋亡等方面的作用。ELISA分析HcESP在细胞因子产生中的作用,结果显示:HcESP能抑制IL-4和IFNγ的产生,且该抑制作用具有剂量依赖性;可以促进IL-10和IL-17的产生。尽管HcESP可以剂量依赖性地显著抑制细胞增殖和NO的产生,但其对细胞迁移却表现出显著的促进作用。我们的研究发现为理解和认识虫体与宿主间的相互作用和HcESP对山羊PBMCs的调节作用提供了基础。2.体外HcESP与山羊PBMCs结合蛋白的蛋白质组学分析本章研究中,我们主要致力于鉴定在体外条件下结合到PBMCs上的HcESP蛋白分子。为了达到这个目的,首先我们将HcESP和山羊PBMCs共培养,然后经免疫荧光分析,确认两者可以相互结合。之后从和HcESP共孵育的山羊PBMCs中提取蛋白,以鼠IgGHcESP为探针进行免疫共沉淀分析。通过液相色谱-串联质谱法分析免疫共沉淀结果,以获得蛋白组分。结果表明,分离出的蛋白包括肌动蛋白、HSP (70)、肌球蛋白、伸长因子α、14-3-3、泛素、微管蛋白α、微管蛋白FtsZ、组蛋白3、组蛋白4和脂肪瘤HMGIC融合伴侣蛋白、ISE/ ISE自交系基因组支架、WORM6蛋白激酶和蛋白激酶域所含蛋白质。根据基因本体论(GO),我们发现这些蛋白分子主要为分子功能和生物过程两类。这些分子主要具有结合活性(54%)和催化活性(31.42 %)。在细胞生物过程中,这些蛋白主要被划分在单生物过程、代谢过程、生物调节和发展过程、多细胞生物过程、生长、应激、定位、增殖、细胞成分的组织和合成以及运动和信号传导过程。本项研究首次报道了结合到山羊PBMCs的HcESP,并对结合上的HcESP进行GO注释。3.体内不同发育阶段HcESP与山羊PBMCs结合蛋白的蛋白组学分析本章研究中,我们通过液相色谱-串联质谱法,鉴定出了不同发育阶段HcESP中和山羊PBMCs结合的蛋白。分别采自人工感染后7天(4期幼虫)、15天(5期幼虫)、40天(早期成虫)和60天(晚期成虫)虫体后的血样。通过Ficoll-Hypaque梯度离心法获得PBMCs。分离得到的PBMCs通过免疫共沉淀法(Co-IP)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定结合到PBMC上的HcESP蛋白。通过SEQUEST搜索,在捻转血矛线虫(H.contortus)蛋白数据库中共找出407种HcESP蛋白,这些蛋白可以在不同的感染时期结合到山羊PBMCs上。与早期成虫和晚期成虫相比,在4期幼虫和5期幼虫的感染时期识别出的蛋白占有较高的比例。在阶段特异性结合蛋白和非阶段特异性蛋白中,有47种蛋白是各发育阶段共有的。被GO注释的结合到PBMCs上的蛋白几乎表达于虫体的所有阶段,并且表现出高结合和催化活性。在GO注释中,细胞代谢和单生物过程作为主要生物过程,但是5期幼虫阶段的大多数蛋白被注释在定位过程。根据同源蛋白聚类,我们对所有阶段鉴定到未注释的蛋白进行了功能注释。通过聚类蛋白株分析,我们对捻转血矛线虫(H. contotus)中一些未命名的ATP结合盒式蛋白进行鉴定,这些蛋白包括ADP-核糖基化因子和P-糖蛋白-9。4. PBMCs结合蛋白rHcftt-2分子的克隆、表达及对PBMC功能的调节捻转血矛线虫(H.contortus)14-3-3蛋白在L4阶段体内结合PBMCs上被鉴定,然后根据成虫14-3-3的CDS (GenBank: accession No. CDJ94531.1)设计特异性的引物。Hcftt-2的开放阅读框(PRF)包含750个核苷酸,编码一条分子量为28kDa的蛋白,此蛋白含132个氨基酸。据预测,Hcftt-2蛋白可能含有13个B细胞的表面抗原表位和13个T细胞的表面抗原表位。序列分析表明,它和已知的14-3-3蛋白亚型2具有很高的同源性。免疫荧光验证了 rHcftt-2对PBMCs的结合活性;rHcftt-2和山羊PBMCs共孵育后观察到它对细胞因子产生、细胞细胞增殖、细胞迁移、NO产生和细胞凋亡的调节作用。运用ELISA方法检测rHcftt-2对细胞因子的产生,结果表明:其可以促进IL-10、IL-17和IFNy的产生,而抑制IL-4的产生。rHcftt-2促进的细胞迁移,并可显著的抑制PBMCs增殖且具有剂量依赖性。在rHcftt-2作用下,PBMCs产生的NO也显著减少。我们同样研究了 PBMCs的凋亡,但对照组和rHcftt-2组没有显著差异。本次研究首次提出了 rHcftt-2分子的功能特征,并且我们的结果为寄生虫-宿主间的相互作用和rHcftt-2对山羊PBMCs的调节作用提供了新的认识和理解。5. PBMCs结合蛋白ADP糖基化因子小GTP酶基因(HcARF1)的克隆、表达对PBMC功能的影响本章研究中,我们对在L4到成虫阶段能够结合到PBMCs上的H.contortusARF基因的CDS (GI: 533372025)设计的特异性引物进行克隆,其在Gene Bank中的编号为HF964523.1。HcARF1的开放阅读框长546bp,编码181个氨基酸,其预测分子量的大小约为20kDa。HF964523.1可能具有6个B细胞抗原表位6个和9个T细胞抗原表位。序列分析显示,rHcARF1和已知的ARF1蛋白具有高度同源性。rHcARF1的重组蛋白以His标签融合蛋白的可溶形式在在大肠杆菌(Escherichia coli.)中表达。免疫荧光验证了 rHcARF1对山羊PBMCs的结合活性;通过共孵育的方法,我们研究了其在细胞因子分泌、细胞增殖、细胞迁移、NO产生、吞噬作用和细胞凋亡等方面的免疫调节作用。rHcARF1可促进IL-4、IL-10、IL-17的产生且呈剂量依赖性,而抑制IFNγ的产生;rHcARF1可显著地促进PBMC迁移和抑制PBMC的增殖且呈剂量依赖性。除此之外,rHcARF1可显著诱导细胞凋亡和促进NO的产生。6. PBMCs结合蛋白富半胱氨酸分泌蛋白抗原5和致病相关蛋白1(Hc-24)的分子克隆、表达及对PBMCs功能的影响。本章研究中,基于捻转血矛线虫(H.contortus)的24kDa排泄分泌蛋白mRNA设计的特异性引物克隆富半胱氨酸分泌蛋白抗原5和致病相关蛋白1(Hc-24),其在Gene Bank中的序列编号为AY821551.1。Hc-24的开放阅读框为609bp,编码202个氨基酸, 其预测的分子量大约为24kDa。Hc-24可能是B细胞抗原表位上的11条肽链和T细胞抗原表位上的3条肽链。序列分析表明Hc-24与捻转血矛线虫(H.contortus)SCP胞外区所含的蛋白的同源性为98%,与捻转血矛线虫(H.contortus) 24Da排泄分泌蛋白同源性为97%,与捻转血矛线虫(H.contortu) cap-2同源性为94%,与捻转血矛线虫(H. contortus) cap-3同源性为93%,与捻转血矛线虫(H.contortus) cap-4同源性为78%。富半胱氨酸分泌蛋白抗原5和致病相关蛋白1(rHc-24)在大肠杆菌中以His标签融合性可溶蛋白形式表达。免疫荧光验证了 rHc-24与山羊PBMCs的结合活性;共孵育后,我们发现rHc-24在细胞因子分泌、细胞增殖和迁移、NO产生、吞噬作用、细胞凋亡作用等方面具有免疫调节效果。rHc-24可促进IL-4、IL-10、IL-17的分泌且呈剂量依赖性,而抑制IFNγ分泌、PBMCs的增殖和NO的产生。同时rHc-24也能诱导PBMCs的迁移和凋亡。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.731
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本文编号：1604439