肠道粘附菌群稳态作为鱼类健康评估指标的探究

发布时间：2018-03-17 14:14

本文选题：鱼类　切入点：肠道健康　出处：《华中农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：动物肠道黏膜表面时时都暴露于复杂和动态的微生物群落之中,因此,肠黏膜层的主要功能之一是作为抵抗驻留在肠腔中的大量细菌的屏障。然而,研究者往往只关注到了黏膜层上皮细胞以及他们之间的紧密连接结构,却常常遗忘和忽视了一个重要的防御系统,那就是粘液层,这一层就是微生物-宿主互作、相互影响的最初接触面。微生物与宿主肠道共同进化形成相互有效的适应机制,并且在不同肠道区域呈现出不同的特点。研究宿主肠道、粘液蛋白以及微生物互作过程中的特点以及关系,对更好的理解微生物与宿主互作提供了基础,为水产动物肠道健康研究以及发掘新的益生菌都具有重要意义。本论文首先通过蛋白质组学、转录组学以及16S测序技术分别对模式动物斑马鱼的肠道粘液、肠道本身、肠道粘液粘附菌群按照斑马鱼肠道自然折叠分段进行了全面透彻的研究,发掘鱼类肠道不同区域的功能、与肠道健康相关的蛋白、基因以及粘附菌群分布差异及特点,揭示肠道粘附微生物稳态对于肠道以及宿主健康的重要性。最后尝试以经济养殖鱼类代表罗非鱼为例说明实际生产养殖中肠道粘附菌群作为肠道健康评价指标的实际应用以及评价意义。主要结论如下:1.通过对正常养殖斑马鱼肠道从前至后自然分为三段的顺序进行粘液染色,发现斑马鱼肠道粘液在不同区域的厚度不一致,但是都只有一层,按照中肠、前肠、后肠的顺序逐渐降低。通过蛋白质组学技术鉴定筛选差异蛋白,中肠与前肠比较有353个,后肠与前肠比较有329个,但是后肠与中肠的比较只有201个,说明前肠差异蛋白的数目最多;随后进行功能富集分析发现,不同肠道区域的显著差异蛋白根据功能多涉及到营养代谢通路,表明主要差异蛋白与营养相关。最后经过筛选获得具有不同黏膜屏障功能的蛋白分布,发现在不同肠道区域分别与机械屏障、化学屏障、免疫屏障以及微生物屏障相关的粘蛋白分布特点,揭示不同肠道区域粘液采用不同的屏障策略。2.转录组学技术比较正常养殖斑马鱼前中后肠差异表达基因,后肠相对于前肠以及中肠具有更大的差异,无论是显著性上调还是下调的基因都在后肠数量上显著高于前肠与中肠,说明在表达模式上后肠的差异性。通路富集分析后,在前肠与中肠之间的显著差异基因一共被注释到8个具有显著差异的通路,在后肠与前肠以及后肠与中肠之间的比较分别具有23个和24个显著差异的通路,其中18个是共同的通路,这也更加说明了后肠的功能差异性。经过筛选与肠道健康相关的基因,我们发现与肠道免疫进程以及肠道上皮发育相关的基因多分布于后肠,前肠相对较少,最少的是中肠,说明肠道在不同区域的免疫调节功能以及细胞屏障功能的差异。但是具有调节粘液分泌以及肠上皮分化的基因gata5在中肠最丰富,与肠道粘液的厚度存在很大的相关性,暗示这一基因在肠道中与粘液屏障的正向关系。3.16S测序技术比较正常养殖斑马鱼前中后肠粘液粘附菌群特点。从整体结构上来看,斑马鱼前中后肠的粘液粘附菌群存在明显的差异,前肠与后肠具有更加相似的结构。不同部位主要以变形菌门(Proteobacteria)为主,随后是梭杆菌门(Fusobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),相对比例存在显著性不同。在属水平上,除去“unknown”的部分,鲸杆菌属(Cetobacterium)和邻单胞菌属(Plesiomonas)占有主要地位,其中鲸杆菌属(Cetobacterium)在前中后肠的不同部位体现出显著性的丰度差异,在中肠的相对丰度最大,达到31.35±1.21%,前肠以及后肠分别为8.67±0.50%和13.14±3.43%。链球菌属(Streptococcus)和乳球菌属(Lactococcus)在前肠丰度最高沿着肠道延伸往后逐渐下降,在中后肠无差异;假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella)在前中肠相对丰度无差异,在后肠显著降低。结合中肠粘液最厚、中肠鲸杆菌属(Cetobacterium)丰度最高的特点以及以往研究,我们认为鲸杆菌属具有更好的鱼类定植能力,是鱼类微生物屏障功能的重要组成部分。以此也说明在评价肠道以及宿主自身健康上粘附菌群不可被忽视以及与内容物菌群混为一团,而应该被单独提出来作为健康评估指标。4.将粘附菌群作为一个鱼类健康指标,结合其他肠道健康相关检测手段,对水产养殖行业在鱼类饲料中植物性蛋白替代鱼粉后添加植酸酶的效果进行评价。1,000 U/kg饲料植酸酶的添加明显改善了粘附菌群多样性:变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和栖热菌门(Thermus)的相对丰度得到提升;从属水平来看,梭菌属(Clostridium sp.)和栖热菌属(Thermus sp.)的相对丰度都受到微生物植酸酶的显著升高调控。伴随着的变化是促进了磷的利用率,升高肠道微绒毛密度的同时降低微绒毛长度;肠道应激因子Hsp70以及炎症因子Tnf-α和Tgf-β的水平都被显著性升高,显示出由于微生物植酸酶的添加诱导了更高的肠道应激和炎症状态。因此本研究认为粘附菌群优化,一定程度能够改善肠道以及宿主福利,但是饮食的直接作用可能会高于菌群优化带来的益处。从本研究可以看出粘附菌群的改变需要得到重视,在评估鱼类健康上,可以从一个新的角度进行说明,但是关于肠道健康与粘附菌群的关系需要更多的深入研究。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917

【参考文献】