金属离子和离子转运蛋白在蚕丝成纤过程中的功能研究

发布时间：2018-03-28 19:00

  本文选题：金属离子　切入点：蚕丝纤维化　出处：《西南大学》2016年博士论文

【摘要】：早在五千多年前,中国古代劳动人民就开始栽桑养蚕,缫丝织绸。在古代中国,蚕丝已经深入人民生活的各个角落,并被广泛地用于服装、艺术、印刷等领域,极大地丰富了当时的社会生活。时至近现代,蚕丝仍然在为人类社会发展服务。除了传统的纺织产业,目前蚕丝还应用于医药卫生、美容、光电、军工、纳米、环境保护等新兴产业。相较于蚕丝的应用研究,关于蚕丝蛋白是如何在家蚕体内成纤维的研究却薄弱得多,蚕丝纤维化的具体机制仍然未被完全阐明。已有的研究结果表明,蚕丝纤维化过程实质上就是丝蛋白内部构象发生转变,形态由液态转变为固态的过程。根据目前由体外实验获得的一些证据,研究者提出这样一种假说:丝蛋白由家蚕丝腺分泌后以液态形式储存,当它流经前部丝腺时,管径突然变细,研究者推测管壁对于丝蛋白会产生剪切力,使得一部分丝蛋白分子开始整齐排布;前部丝腺的酸性环境使得丝蛋白酸化脱水,一方面使丝蛋白浓缩,另一方面使丝素蛋白的N末端发生二聚化;前部丝腺还具有适宜的金属离子强度,金属离子可与丝蛋白中的某些氨基酸残基发生静电相互作用;丝素蛋白二聚化以及丝素和金属离子的相互作用进一步将分子拉近并紧密排列,使丝蛋白形成液晶态结构;当丝蛋白进入吐丝器后,吐丝器肌肉强大的压缩伸展作用会提供更为强大的剪切力,将丝蛋白中多余的水分脱去;随后,家蚕头胸部的摆动使得丝蛋白受到拉伸力的作用,分子沿着丝纤维的长轴整齐紧密排列,从而形成固态的丝纤维。根据以上假说可以看出,家蚕的前部丝腺和吐丝器实际上就是丝蛋白纤维化的场所。要探究丝蛋白纤维化过程,对于这两个组织的研究必不可少。2013年本实验室对家蚕前部丝腺进行了蛋白质组学研究,为本文的探讨奠定了基础。家蚕有几个重要器官与蚕丝合成和分泌相关。其中,吐丝器较为微小,对其的研究还处于形态学观察阶段。而家蚕的菲氏腺是连接于吐丝器的微小腺体,功能不明。目前吐丝器、菲氏腺中基因、蛋白的表达情况以及其与丝蛋白纤维化的关系仍然未知。另外,由于模拟家蚕前部丝腺和吐丝器内的生理生化环境十分困难,导致以上假说均是由体外实验获得的研究结果,体内的真实情况仍然未知。金属离子是否能在体内条件下与丝蛋白结合并通过与丝蛋白发生相互作用,来改变丝蛋白的构象还不明确。蚕丝蛋白质中的二级结构变化会影响蚕丝纤维的力学性能。蚕丝纤维的形成过程即是蚕丝蛋白二级结构改变的过程,也是赋予蚕丝纤维力学性能的过程。因此如果对蚕丝纤维形成过程的诸多要素,例如金属离子浓度等,进行调控,人为地改变蚕丝蛋白的二级结构,那么就有可能对蚕丝纤维的力学性能进行改造。这个思路是本文研究的重点之一。鉴于此,本研究采用分子生物学、化学、材料力学等多种技术手段,以金属离子为切入点,对家蚕丝纤维形成过程进行研究,并且利用转基因的方法,人为地改变蚕丝纤维形成的离子环境,获得了能够稳定遗传的、可生产高力学性能蚕丝的转基因家蚕素材。本研究获得的主要研究结果如下:1.家蚕吐丝器及菲氏腺的转录组学分析本研究首先对盛食期(五龄第3天)和吐丝期(上蔟第1天)的吐丝器和菲氏腺进行了转录组学的研究。共在吐丝器中鉴定到11000多个基因。对这些基因进行功能注释,发现它们很多涉及离子结合和转运、几丁质结合与代谢、表皮构建等功能,极有可能参与了丝蛋白的纤维化。吐丝器中共鉴定到59个离子转运蛋白基因,其中7个负责ca~(2+)转运,表达量最高的离子转运蛋白基因为内质网型钙离子atp酶(bmserca)基因;吐丝器中鉴定到大量的氢离子转运蛋白基因,它们大多是空泡型氢离子atp酶(v-atpase)各个亚基的编码基因;吐丝器中还有na~+、k~+、zn~(2+)、cu~(2+)和po43-转运蛋白编码基因的表达,以上研究结果说明了吐丝器与前部丝腺一样具有活跃的离子转运功能,能为丝纤维形成提供适宜的生理生化环境。通过转录组学及go富集分析,发现吐丝器与菲氏腺的差异基因均富集到了与小分子跨膜转运相关的功能上,说明菲氏腺可能负责将一些小分子物质(如水和离子)转运到丝腺腔中。通过结合转录组数据、基因芯片数据及rt-pcr分析,本研究鉴定到一个菲氏腺特异表达的基因bgibmga013432。此基因注释为假定转运体。2.家蚕吐丝器的蛋白质组学分析在转录组的基础上,本研究进一步对上述两个时期的吐丝器进行了蛋白质组学研究。分别在两个时期鉴定到1355和1315个蛋白。对蛋白进行分类后发现,吐丝器中与丝蛋白纤维化密切相关的蛋白(如表皮蛋白、离子转运蛋白、肌肉运动相关蛋白和能量代谢蛋白)丰度较高。信号途径分析发现吐丝器具有活跃的能量代谢、蛋白质合成和降解过程。通过差异分析,总共在两个时期筛选出差异蛋白232个,其中上调蛋白184个,下调蛋白48个。这些差异蛋白主要参与了能量代谢、几丁质结合和表皮构建过程。这说明在吐丝器中,活跃的能量代谢过程为肌肉收缩,离子和水的转运提供丰富的能量,而几丁质结合和表皮构建过程也为丝蛋白纤维化提供足够的剪切力及自我保障。这进一步证明了吐丝器能为丝纤维形成提供适宜的生理生化环境。3.家蚕内质网型钙离子atp酶的功能研究bmserca是在吐丝器中表达量最高的离子转运蛋白基因,本部分首先对其进行了信息分析,发现其高度保守。随后克隆了这个基因,对其胞内段进行原核表达、纯化、制备多克隆抗体。利用杆状病毒表达系统获得了具有生物学活性的重组serca蛋白,本研究发现,在细胞感染后48h重组蛋白开始表达,到96h表达量最大,并且分析发现重组蛋白还具有较高的酶活。对bmserca基因在丝腺中的表达模式进行分析时发现,不管是转录水平、蛋白水平还是酶活水平,其都在前部丝腺表达量最高。为了研究bmserca的功能,向上蔟期的家蚕血淋巴注射了serca的特异型抑制剂毒胡萝卜素(tg)。当向家蚕注射2nmol的tg后,发现家蚕茧壳中的钙元素含量上升,说明bmserca是调控丝腺和丝蛋白间ca~(2+)平衡的关键因子。通过ftir分析,发现注射后的茧丝二级结构含量也发生变化,螺旋和无规则卷曲结构含量增多,中间结构和β转角结构含量降低,说明bmserca参与了家蚕丝蛋白的构象转变。4.金属离子调控丝蛋白构象及力学性能前部丝腺和吐丝器是丝蛋白构象转变的场所。本研究调查了丝腺不同区段中金属元素含量及离子转运蛋白基因的表达情况。结果显示钠、钾、镁、铜和锌元素含量由后到前逐渐升高,而钙元素含量下降。通过qrt-pcr分析,发现丝腺不同区段离子转运蛋白基因的表达量不同,其中前部丝腺和吐丝器中氢离子转运蛋白基因、钠钾离子转运蛋白基因、钙离子转运蛋白基因和铜离子转运蛋白基因的表达水平很高。利用向再生丝素中添加不同浓度的金属离子和直接向家蚕注射金属离子的方法分别在体外和体内条件下研究了金属离子对丝蛋白构象转变及力学性能的影响。圆二色光谱分析表明k~+能剧烈地诱导再生丝素产生β折叠结构,而na~+却不能。ca~(2+)与cu~(2+)作用于丝素蛋白构象转变的情况类似,都只在特定浓度下诱导β折叠结构的产生。通过注射的方法研究了金属离子是否在体内参与了丝蛋白的纤维化及金属离子与丝纤维性能的关系。利用红外光谱比较茧丝的结构,发现注射k~+及cu~(2+)后丝纤维的β折叠含量显著增加,力学性能测试发现注射后茧丝较对照相比更强更硬。注射ca~(2+)后茧丝的无规则卷曲、螺旋结构含量增加,而β转角结构含量下降,茧丝的延展性和韧性提高。以上的实验结果说明,金属离子可以在体内调控丝蛋白的构象转变,参与了丝蛋白的纤维化过程,并影响丝纤维的力学性能。5.利用金属离子对蚕丝纤维的力学性能进行改良在前面研究的基础上,本部分通过基因操作技术对蚕丝蛋白纤维化的离子环境进行了编辑,改变了蚕丝蛋白的构象并获得了力学性能稳定提高的蚕丝纤维。利用纺丝管道特异启动子bmcp231分别将家蚕的钙离子转运蛋白bmserca和钠钾离子转运蛋白bmnka进行了过量表达。结果发现在转基因家蚕中,相应基因和蛋白在前部丝腺得到过量表达的同时,转基因家蚕各个组织及茧壳中的元素含量与对照相比具有显著的差异。这说明转基因家蚕体内的离子转运产生了变化,但是并没有对转基因家蚕的经济性状和茧与茧丝形态产生显著影响。进一步分析转基因家蚕的茧丝,发现过量表达bmserca的转基因蚕丝β折叠和螺旋结构含量增加,相应的强度,延展性和韧性都显著增加,其中强度增加了21%、延展性增加了54%、韧性提高了73%,而刚度与对照相比没有太大差异。过量表达bmnka的转基因蚕丝无规则卷曲含量增加,β折叠结构含量下降,最终导致其力学性能发生显著下降。这一结果说明改变家蚕丝纤维形成的离子环境可以调控丝纤维的力学性能,进而对丝纤维性能的改良提供一个全新的视角。综上所述,本论文从全新的角度、系统的策略、多学科的技术手段,揭示了吐丝器和菲氏腺中基因(蛋白)表达情况,证明了金属离子在体内条件下参与了丝蛋白纤维化过程。通过对丝蛋白纤维化形成过程的离子环境入手,获得了迄今首个不改变蚕丝蛋白序列即可改良蚕丝力学性能的转基因家蚕素材。本研究必将为蚕丝纤维形成机制的阐明及新型蚕丝纤维的开发提供新的起点和方向。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S881.2
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本文编号：1677624