外生菌根真菌和深色有隔内生真菌提高油松抗松萎蔫病机制的研究

发布时间：2018-03-31 16:22

  本文选题：松萎蔫病　切入点：外生菌根真菌　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文

【摘要】：本论文采用高通量测序(Illumina Mi Seq)技术研究了陕西柞水县松萎蔫病(Pine Wilt Disease,PWD)的发生对油松(Pinus tabulaeformis Car.)根部和根际真菌、细菌群落分布的影响,分析了PWD与土壤理化性质的关系。筛选了抗PWD的外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi,ECMF)和深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes,DSE)菌株,将ECMF和DSE与松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus,Pinewood Nematode,PWN)接种油松幼苗,从油松幼苗抗病相关酶和抗病相关物质以及PWN侵染对油松根部和根际微生物群落结构变化的影响等方面初步揭示了ECMF和DSE提高油松抗PWD的机制。得出以下主要结果:1.土壤理化性质与PWD的关系选择未受PWD干扰(Undisturbed UD)、PWD中度干扰(Middle Disturbed,MD)和严重干扰(High Disturbed,HD)的3个油松林分,研究了PWD干扰和土层深度对土壤因子的影响。不同样地、不同土层土壤理化性质主成分分析表明,5~30 cm土层土壤理化性质比30~45 cm更容易受PWD的影响。相关性分析表明,PWN侵染率与根际菌丝密度、土壤pH和土壤全磷呈显著负相关,与土壤蔗糖酶活性呈显著正相关;松树死亡率与根际菌丝密度和土壤pH呈显著负相关,与土壤全氮、硝态氮和土壤有机质含量呈显著正相关。2.PWD不同干扰样地油松根际真菌和细菌分布利用高通量测序的方法研究了PWD干扰对根际细菌和真菌群落分布的影响,结果表明油松根际主要真菌类群是担子菌门Basidiomycete和子囊菌门Ascomycota;主要细菌类群是变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria和放线菌门Actinobacteria。随PWD干扰程度的增加,油松根际担子菌门真菌相对丰度由81.45%(UD)急剧减小到46.85%(MD)和44.45%(HD);而子囊菌门真菌相对丰度则由17.59%(UD)急剧增加到50.74%(MD)和52.66%(HD)。油松根际细菌各类群相对丰度在不同林分变化不太明显。聚类分析表明PWD干扰林分与非干扰林分油松根际的细菌和真菌分类学组成相似性不同。随PWD干扰程度加重真菌丰富度先增加后减小,多样性逐渐增加;细菌丰富和多样性度逐渐减小。PWD的干扰显著(P0.001)降低了油松根际的菌丝密度,从1334.6 mm g~(-1)(UD)降低到606.1 mm g~(-1)(HD)。3.油松根部ECMF和DSE等真菌侵染程度、群落结构与PWD的关系用高效液相色谱法得到PWN的侵染显著降低了油松根部真菌的生物量,从未受侵染的0.272 mg g~(-1)降低到0.182 mg g~(-1)。相关性分析表明PWD与ECMF和DSE的侵染率有显著的相关关系,ECMF侵染率随PWD干扰程度升高显著降低,从84.4%(UD)降低到64.1%(HD),而DSE侵染率先降低后升高,在UD、MD和HD样地中的侵染率分别为52%、45.3%和66.7%,并且PWN的侵染降低了ECMF类群的相对丰度和群落多样性。UD、MD和HD林分油松根部真菌的OTU数目分别为69个、70个和55个,其中UD林分特有OTU有9个,MD和HD林分分别特有8个和3个。块菌属Tuber、红菇属Russula、伞菌纲Agaricomycetes、口菇属Tricholoma和长毛盘菌属Trichophaea真菌的相对丰度较高,所占比例达80%以上,但各个类群在不同样区的相对丰度不同。随PWD干扰程度的增加,口菇属真菌相对丰度增加;而伞菌纲和长毛盘菌属真菌相对丰度先增加后降低;块菌属和红菇属真菌的相对丰度则是先降低后增加。主成分分析表明不同PWD干扰程度真菌群落组成上有显著差异。4.油松抗PWD ECMF和DSE菌株筛选将不同ECMF和DSE与PWN接种油松幼苗,测定油松的生长特性和抗病性。结果显示不同真菌对油松的生理指标和根系形态的影响不同。主成分分析表明,接菌处理在整体上促进了油松苗的的生长,并且ECMF和DSE这两类群真菌之间对油松的接种效果没有显著差异。皮尔森相关性分析表明,PWN侵染发病率与根长、根分叉数和根表面积显著负相关与类胡萝卜素含量显著正相关;油松组织含水量与松苗死亡率显著负相关。模拟自然土壤条件接种ECMF和DSE于油松幼苗,筛选出能提高油松抗PWD的2株ECMF(灰鹅膏菌Amanita vaginata、粘盖牛肝菌Suillus bovinus)和2株DSE(柱孢顶囊壳菌Gaeumannomyces cylindrosporus和菊异茎点霉Paraphoma chrysanthemicola)菌株。接种PWN 3个月后这4个ECMF和DSE菌株G.cylindrosporus、A.vaginata、S.bovinus和P.chrysanthemicola油松苗发病率分别比对照组低16.67%、26.67%、20%和6.7%,;死亡率比对照处理低20%、26.67%、23.33%和10%。表明这4株ECMF和DSE能够增强油松抗病性。5.接种ECMF和DSE油松幼苗抗病相关酶和抗病相关物质对PWN侵染的响应根据抗PWD筛选结果,研究了接菌油松幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等抗病相关酶活性和木质素、可溶性酚、丙二醛和脯氨酸抗病相关物质含量对PWN侵染的响应。结果表明,PWN侵染后,接种A.vaginata、G.cylindrosporus处理能够诱导油松迅速提高PAL酶活性,说明在受到PWN侵染时A.vaginata、G.cylindrosporus可能激活了油松的水杨酸(SA)抗病信传导途径。接种PWN后,接种A.vaginata、S.bovinus、G.cylindrosporus和P.chrysanthemicola的油松LOX活性分别降低了19.59%、40.98%、17.08%和30.50%,说明接菌可能降低了油松因PWN侵染而引起的过敏性反应。PWN侵染后P.chrysanthemicola和G.cylindrosporus处理油松可溶性酚含量分别增加了43.04%和6.93%,而接种A.vaginata、S.bovinus反而使油松可溶性酚含量降低了2.02%和9.73%;接种A.vaginata、S.bovinus和P.chrysanthemicola处理的油松木质素含量分别升高37.95%、3.64%和85.97%,而接种G.cylindrosporus处理油松木质素含量降低了4.14%。在PWN侵染之后A.vaginata、S.bovinus油松游离脯氨酸含量比对照组分别高出140.79%、84.44%。但是β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与阳性对照组没有显著的差异。说明接种ECMF、DSE能够通过调节抗病相关酶活性和抗病相关物质含量,提高油松对PWD的抗性。6.接种ECMF和DSE油松幼苗根部微生物对PWN侵染的响应对接种ECMF和DSE的油松苗在感染PWN后3个月、6个月和9个月的油松根尖真菌群落结构和根际微生物群落结构,以及微生物量碳和土壤酶活进行测定。结果表明PWN侵染下,接种A.vaginata、S.bovinus、G.cylindrosporus和P.chrysanthemicola的油松根际微生物量碳含量比对照组分别高出38.16%、49.67%、42.11%和96.05%,说明在PWD干扰的情况下,接种ECMF和DSE能够减缓油松根际微生物量的降低。接菌处理和PWN的感染都会影响土壤酶活性,在受到PWN侵染时,不同接菌处理对土壤酶活性的影响方式不同。利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法分析了PWN的侵染对接菌油松根际真菌和细菌的菌落结构的影响。结果发现,PWN的侵染降低了油松真菌的丰富度和多样性;接种外源菌剂,保持了油松根部真菌群落的稳定性,使油松根部真菌群落受PWN的影响减少;不同接菌处理对油松根际细菌丰富度和多样性的影响不同,油松接种ECMF/DSE可以增加根际有益细菌如伯克氏菌目Burkholderiales、根瘤杆菌属Rhizobacter sp.、根瘤菌属Mesorhizobium sp.等细菌的相对丰度。说明在PWN侵染下,接种ECMF/DSE能够改善油松根际微环境,增加微生物群落稳定性,从而提高油松的存活能力,增强对PWN的抗性。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763.7
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本文编号：1691507