丝氨酸蛋白酶SP1、SP13、SP105在亚洲玉米螟天然免疫反应中的功能及作用机制

发布时间：2018-04-02 13:19

本文选题：亚洲玉米螟　切入点：黑化反应　出处：《中国农业大学》2017年博士论文

【摘要】：昆虫缺乏脊椎动物所具有的获得性免疫系统,主要依赖发达的天然免疫系统来抵御病原物的入侵。昆虫天然免疫反应由体液免疫和细胞免疫组成,其中体液免疫反应主要包括抗菌肽的产生和黑化反应。酚氧化酶是黑化反应的关键酶,其激活依赖于级联反应的丝氨酸蛋白酶途径。丝氨酸蛋白酶(serineprotease,SP),尤其是具有发夹结构的丝氨酸蛋白酶(clip domain serine protease),在黑化反应中发挥着重要功能。它们是一类以丝氨酸残基为活性中心的蛋白水解酶,由两部分组成——位于N端的发夹结构(clip domain)和位于C端的催化区域(catalytic domain),其中催化区域中存在一个由组氨酸,丝氨酸和天门冬氨酸组成的催化三角。丝氨酸蛋白酶在体内以酶原的形式存在,当病原物入侵信号被识别后,一系列丝氨酸蛋白酶被级联激活,最终导致酚氧化酶原激活酶(prophenoloxidase-activating protease,PAP)被激活,进而切割激活酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)产生有活性的酚氧化酶(phenoloxidase,PO)导致黑色素的形成。黑化反应被丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin)所调控,以防黑化反应的过度进行对昆虫本身产生伤害。丝氨酸蛋白酶抑制剂通过识别特异的丝氨酸蛋白酶并与之结合形成稳定的共价复合物,从而抑制丝氨酸蛋白酶的活性,起到调控黑化反应的作用。亚洲玉米螟是重要的农业害虫,为探究其天然免疫反应的分子机制,本文首先检测了病原微生物入侵亚洲玉米螟幼虫后的免疫活性,确定了亚洲玉米螟被外源物诱导后确实能产生天然免疫反应。随后我们选取了 3个丝氨酸蛋白酶(OfSP1、OfSP13、OfSP105)和3个丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin-3、serpin-6、serpin-11)为研究对象,利用分子生物学和生物化学等手段,研究了它们之间的相互关系,及在黑化反应中的功能和作用机制,得到了以下研究结果:1.球孢白僵菌的入侵,可明显诱导亚洲玉米螟幼虫的黑化反应,并显著提高幼虫淋巴液的酚氧化酶活性。2.病原微生物侵染亚洲玉米螟幼虫可显著提高淋巴液的抗菌活性,其中3种抗菌肽基因(OfgLys6、OfgAtt和OfgIID)属于诱导型表达基因。3.我们成功克隆了 3种丝氨酸蛋白酶基因(SP1、SP13、SP105)的全长序列,并对其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。它们的时空和诱导表达模式互不相同。4.我们利用Bac-to-Bac真核表达系统成功表达了 SP1、SP13、SP105重组蛋白,并利用生化手段获得了纯化的重组蛋白,其中SP1、SP13、SP105的激活位点被突变成了可被商业化蛋白酶FactorXa识别切割的IEGR,获得了可在体外被激活的SP1、SP13、SP105蛋白。5.利用获得的重组蛋白进行一系列研究表明:在亚洲玉米螟黑化反应的发生过程中,SP1是SP13的上游蛋白酶,能直接切割激活SP13酶原。激活的SP13可进一步切割激活酚氧化酶原,因此SP13是一个酚氧化酶原激活酶。与此同时,SP1不能激活SP105酶原,但是FactorXa体外激活的SP105也可以直接切割激活酚氧化酶原,也是一个酚氧化酶原激活酶。6.丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3和seprin-6均可与SP13和SP105形成稳定复合物,并抑制它们激活酚氧化酶原。Seprin-6还可与SP1结合形成复合物,但serpin-11与SP1、SP13、SP105均不能形成复合物。所以,serpin-3和serpin-6可调控亚洲玉米螟的黑化反应,但serpin-11无此功能。本论文的创新之处在于:我们首次克隆了 3个亚洲玉米螟丝氨酸蛋白酶基因——SP1、SP13和SP105,并且明确了它们在黑化反应中的作用机制,还解析它们被3个丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3、serpin-6、serpin-11调控的分子机制。我们首次在亚洲玉米螟中得到2个酚氧化酶原激活酶,这为进一步解析亚洲玉米螟乃至其他昆虫的天然免疫分子机制提供了基础,也为将来利用亚洲玉米螟的天然免疫系统进行生物防治提供了理论依据。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.132

【参考文献】