锌转运蛋白Zip11的功能及沙门氏菌攻击对肉鸡锌稳态的影响及调控机理研究

发布时间：2018-04-10 17:52

本文选题：ZIP11 + 肉鸡　；参考：《四川农业大学》2016年博士论文

【摘要】：锌是机体必需的微量元素,机体需要准确地调节锌稳态平衡,让锌水平维持在正常的范围内。机体的锌稳态调控主要是由锌转运蛋白ZNT与ZIP家族负责。ZIP11则是ZIP家族全新的基因,之前尚未见关于ZIP11功能的研究报道。由沙门氏菌污染禽肉引起的人食源性疾病仍然是世界卫生组织面临的主要问题之一。肉鸡大肠杆菌感染或内毒素刺激均会出现典型的“低锌血症”,血清锌降低,肝脏锌升高；同时多项研究暗示病原微生物感染可能会影响机体先天免疫细胞(如中性粒细胞与巨噬细胞)的锌稳态。但沙门氏菌感染对肉鸡锌稳态的影响与调控机理目前仍不清楚。锌转运蛋白在其中的作用也是未知,ZIP11是否参与其中有待研究。本研究将全面系统地回答这些问题,共开展以下三项研究：实验一：ZIP11在机体锌代谢中的作用与机理研究本研究以野生型小鼠与细胞系为模型,全面系统地研究ZIP11在机体锌代谢中的作用与机理。首先通过生物信息学分析ZIP家族在真核上的分布规律与进化关系,从不同的真核生物类群(如哺乳动物、脊椎动物、植物与原生动物等)中挑选了25种具有代表性的真核生物的ZIP基因进行分析。结果发现,ZIP11是ZIP家族gufA亚家族的唯一成员,起源于真核生物早期的祖先。在分析Zip11在小鼠不同组织中的表达规律,发现mZip11在消化系统中高表达(胃、回肠与盲肠)。而在HEK293T细胞上转染mZIP11质粒与在RAW26.7细胞上沉默Zip11后,测定细胞内锌含量与MT的基因表达,证实ZIP11是一个锌的转入蛋白。给野生型小鼠补锌后,发现Zipll无论是mRNA还是蛋白水平均显著升高。随后的荧光素酶报告基因分析发现Zip11第一个外显子上游区域存在多个MRE序列,可响应细胞内锌的变化。突变分析的结果发现很多MRE可调控Zip11启动子的活性,MTF-1参与到Zip11表达调控的过程中。总之,本实验结果表明ZIP11具有特殊的序列与结构特征,负责细胞内锌的转运,锌通过MTF-1绑定到Zip11启动子区域的MRE序列上调控Zipll的基因表达。实验二：沙门氏菌感染对肉鸡锌稳态的影响及调控机理研究实验选用48只1dAA肉公鸡,饲养7d后按体重无差异原则随机分为两组：组为对照组,另外一组为沙门氏菌攻毒组。分别在攻毒后第1、3与7d收集血清、肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊、十二指肠、空肠、回肠与盲肠等组织,用于锌含量与锌代谢相关基因的分析。同时,分离正常与被感染鸡只的血液中性粒细胞,检测钙卫蛋白与锌代谢相关基因的表达。研究表明,7 d肉鸡沙门氏菌感染后血清锌显著降低(P0.05),肝脏锌明显升高(P0.05),机体出现了典型的“低锌血症”。与对照组相比感染组十二指肠中锌含量极显著降低(P0.01),但法氏囊与盲肠中的锌含量显著升高(P0.05)。机体通过限制十二指肠对锌的吸收,同时将锌重分布到肝脏、法氏囊与盲肠等组织,从整体上调控锌的稳态平衡,来限制沙门氏菌对锌的吸收与利用。除此之外,沙门氏菌感染后极显著地增加中性粒细胞MT与S100A9的表达(P0.01)。机体通过改变中性粒细胞的锌稳态,从而介导钙卫蛋白的表达与分泌,分泌到肠腔中的钙卫蛋白会螯合掉食糜中的锌,进一步限制沙门氏菌对锌的吸收与利用。沙门氏菌感染对肉鸡的锌稳态的影响主要是通过显著改变宿主锌转运蛋白的表达来实现的(P0.05)。宿主通过上调锌的转入蛋白ZIP14,下调锌的转出蛋白ZNT1、ZNT、ZNT5、ZNT6、 ZNT8与ZNT9的表达将锌重分布到肝脏；此外下调ZIP5、ZIP10、ZIP11、ZIP12、 ZIP13与ZIP14在十二指肠中的表达,限制锌的吸收。进一步研究发现,机体会上调中性粒细胞中的锌转运蛋白ZIP3、ZIP8、ZIP10与ZIP14的表达,增加中性粒细胞中的锌含量,从而极显著增加钙卫蛋白的表达(P0.01)。总之,沙门氏菌感染显著影响肉鸡的锌稳态。机体通过调控锌转运蛋白的表达在整体水平与细胞水平上分别介导锌稳态调控,来共同抵抗沙门氏菌的感染。多个锌转运蛋白在这个过程中发挥重要的作用,ZIP11也参与到其中。实验三：巨噬细胞游离锌调控在抗沙门氏菌感染中的作用与机理研究本研究以RAW264.7巨噬细胞为模型,在沙门氏菌感染的同时,通过添加锌或锌螯合剂改变巨噬细胞内游离锌的水平,利用荧光显微、流式细胞仪、RT-PCR与免疫印迹等技术检考察游离锌改变对沙门氏菌感染与增殖的影响；同时考察游离锌改变对宿主NF-κB信号通路以及ROS与RNS产生的影响。除此之外,还在MT1敲除的RAW264.7巨噬细胞上验证之前的结果。研究发现在巨噬细胞感染沙门氏菌后游离锌会聚集在巨噬细胞内,并影响沙门氏菌的感染。螯合巨噬细胞内的游离锌通过增加巨噬细胞ROS与RNS的产生,增加巨噬细胞对沙门氏菌的杀伤,从而减少沙门氏菌的感染。相反,额外增加巨噬细胞的水平通过影响NF-κB p65的激活,减少ROS与RNS的产生,结果沙门氏菌在巨噬细胞内生长得更好。在敲掉细胞内重要的游离锌绑定蛋白MT1后,沙门氏菌在MT1敲除的巨噬细胞内生长的更好。这是由于伴随巨噬细胞内游离锌含量升高的同时,细胞内ROS与RNS的产生也减少。深入研究发现沙门氏菌阳性的细胞相比沙门氏菌阴性的细胞含有更多的自由锌,而ROS与RNS的产生被抑制。这暗示感染后巨噬细胞游离锌的聚集可能是沙门氏菌逃避NF-κB介导的巨噬细胞杀伤,长久地在巨噬细胞内生存的新策略。综上所述,ZIP11是一个锌转运蛋白,在机体锌代谢过程中发挥重要作用。此外,ZIP11的mRNA与蛋白水平均受锌调控,锌调控ZIP11的表达主要通过MTF-1绑定到ZIP11扁动子区域的MRE序列上来实现。肉鸡沙门氏菌感染后,机体通过调控十二指肠锌的吸收,同时将锌重分布到肝脏、法氏囊与粒细胞等组织或细胞,从整体与细胞水平上调控机体的锌稳态,共同抵抗沙门氏菌的感染,ZIP11也参与到其中。在肉鸡体内沙门氏菌感染后,机体出现血清锌降低,可能会减少体内巨噬细胞内游离锌的含量,有利于宿主对沙门氏菌的清除。但值得注意的是,体外巨噬细胞沙门氏菌感染模型中的结果提示,沙门氏菌可通过改变巨噬细胞的锌稳态,抑制巨噬细胞对其杀伤,长期在巨噬细胞内存活。
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【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31

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