沙打旺黄矮根腐病菌分子生物学研究

发布时间：2018-06-23 04:08

  本文选题：重新分类 + PCR　； 参考：《兰州大学》2016年博士论文

【摘要】：沙打旺(Astragalus adsurgens)是我国特有豆科牧草,适宜于干旱、半干旱和半荒漠地区,具有治理水土流失等生态作用。沙打旺黄矮根腐病是由沙打旺埃里砖格孢(Embellisia astragali)引致的沙打旺上最重要的病害之一,为系统性病害、气传病害和种传病害。此前研究表明该病菌的形态特征及在寄主体内的生活特性与疯草内生真菌(Alternaria spp.=Undifilum spp.,Embellisa spp.)相似,但由于尚未见其分子生物学方面的报道,故二者相似的论断尚缺少分子生物学的佐证。为减少种子传播途径和分子育种,减少病害的发生,有必要研制出种带该病菌的快速检测技术,以及挖掘出其致病基因。为此,本论文开展了相关研究,得到如下主要结果。1.基于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、RNA聚合酶II第二大亚基(RPB2)和转录延伸因子1-α(TEF-1)的联合多基因构建的系统发育树,确定该病菌与链格孢属波浪芽管孢组Genus Alternaria Section Undifilum的模式种A.bornmuelleri DAOM 231361均属于同一组;基于核糖体编码基因内转录间隔区(ITS)和GPD多基因构建的系统发育树,显示该病菌与6种疯草中的4种疯草内生真菌不同,属另一物种,两个系统树中上述两个分支的MP自展支持率和贝叶斯后检支持率都分别为100%和1.00;再加上此菌也具有链格孢属波浪芽管孢组典型形态特征“波浪芽管”,鉴于种加词“astragali”已被其他真菌占用。故将其更名为甘肃链格孢Alternaria gansuense comb.nov.,厘清了沙打旺黄矮根腐病菌与疯草内生真菌之间的关系。2.根据细胞质膜三磷酸腺苷水解酶基因片段(ATPase)设计出此菌的特异性检测引物AatpF(GTCGAGAGTTTTTTCTT)和AatpR(GGTGGAGCTGGGTTGTTTTA),利用此特异引物进行普通PCR,可检测出沙打旺种子中5 pg/μL以上的此病菌DNA,带菌率1.5%的种子;荧光定量PCR拟合方程为Ct=-3.226×(log[DNA])+29.055,相关系数为0.9987,最低可以检测0.5 pg/μL沙打旺黄矮根腐病菌DNA。运用本方法可以准确快速检验检疫沙打旺种带黄矮根腐病菌,预防该病在新建植人工栽培沙打旺草地致病成灾。3.根据线粒体内核糖体小亚基编码基因(mtSSU)基因设计出疯草内生真菌特异性检测引物OmtssuF(CATAGAAAAAAAAATAAACAAACTG)和OmtssuR(TGTCTGCCCAGGTTACGG),利用此特异引物进行普通PCR检测,最低检测疯草样品中含5 pg/μL内生真菌DNA,荧光定量PCR拟合方程为Ct= 2.9105*(log[DNA])+31.213,相关系数为0.9973,最低检测限为5 fg/μL疯草内生真菌DNA。该方法可以应用于揭示疯草中内生真菌含量与有毒物质苦马豆素含量之间的关系研究中。4.以基因组DNA为模板,采用真菌钙调素保守区兼并引物CAL-228F和CAL-737R扩增得539 bp的同源片段;采用Hi-TAIL PCR分别获得344 bp的5’侧翼序列和729 bp的3’侧翼序列,拼接获得基因的1290 bp的全长DNA序列;利用全长引物CaMF和CaMR,得到840 bp的DNA全长序列和450 bp的cDNA全长序列,DNA全长序列中有4个内含子,均具有典型的AT-AG特征,cDNA全长序列翻译出149氨基酸多肽,与其他真菌的钙调素高度同源。再次采用Hi-TAIL PCR技术克隆钙调素基因5′端992 bp和3′端1096 bp的侧翼序列,在此基础上,用Split-Marker技术,构建了沙打旺黄矮根腐病菌钙调素基因的敲除载体,为后续阐明其调控该菌生物学功能、致病性机制奠定基础。5.将液体摇瓶培养15天的沙打旺黄矮根腐病菌菌丝为材料,以0.6 M MgSO4为稳渗剂,20 mg/mL Glucanex+20 mg/mL Glucanase+20 mg/mL纤维素酶+0.16 UN/mL几丁质酶复配,30℃,120 rpm水浴振荡酶解6 h,四层擦镜纸-漏斗法过滤收集原生质体。先液体后固体,自然涂布法于RM培养基上,25℃培养15~20天可再生,为后续开展REMI遗传转化建立突变体库及基因敲除奠定基础。
[Abstract]:Astragalus adsurgens is endemic in China . It is suitable for arid , semi - arid and semi - desert areas . It is one of the most important diseases caused by Embellisia spp . In order to reduce the propagation and molecular breeding of seeds and to reduce the occurrence of diseases , it is necessary to develop a rapid detection technique with the pathogen and a phylogenetic tree constructed by combining multiple genes of transcription extension factor 1 - 伪 ( TEF - 1 ) . ,鍘樻竻浜嗘矙鎵撴椇榛勭煯鏍硅厫鐥呰弻涓庣柉鑽夊唴鐢熺湡鑿屼箣闂寸殑鍏崇郴.2.鏍规嵁缁嗚優璐ㄨ啘涓夌７閰歌吅鑻锋按瑙ｉ叾鍩哄洜鐗囨��(ATPase)璁捐�″嚭姝よ弻鐨勭壒寮傛�ф��娴嬪紩鐗〢atpF(GTCGAGAGTTTTTTCTT)鍜孉atpR(GGTGGAGCTGGGTTGTTTTA),鍒╃敤姝ょ壒寮傚紩鐗╄繘琛屾櫘閫歅CR,鍙�妫�娴嬪嚭娌欐墦鏃虹�嶅瓙涓�5 pg/渭L浠ヤ笂鐨勬�ょ梾鑿孌NA,甯﹁弻鐜，

本文编号：2055700