基于受体蛋白MphR（A和E）的类ELISA构建及在大环内酯类药物残留检测的初步应用

发布时间：2018-06-24 13:47

本文选题：大环内酯类抗生素 + 红霉素　；参考：《中国农业科学院》2016年博士论文

【摘要】：长时间大规模使用大环内酯类抗生素将产生风险。为了对大环内酯类抗生素进行有效及时监管,需要发展各种检测方法构成完善的检测方法网络。目前市场上大环内酯类抗生素残留检测方法有多种,但各种方法均存在相应不足。利用大环内酯类抗生素调控蛋白MphR(A)或MphR(E)与特异双链DNA序列的结合-解离作用,可以建立类似酶联免疫法的类ELISA系统,以检测大环内酯类抗生素物质。这种系统的优点是可检测多种大环内酯类抗生素。目前已有利用MphR(A)蛋白建立的体内外检测系统文献报道,但尚无以MphR(E)蛋白建立的检测系统报道。为了进一步研究以调控蛋白-DNA相互作用为基础的大环内酯类抗生素检测系统,本实验以类ELISA方法为手段,以Mph R(A)及其DNA相互作用为模板,对比研究MphR(A)和MphR(E)蛋白及与蛋白相互作用的DNA序列。本实验的基本路线是将合成的MphR(A)和Mph R(E)蛋白基因分别构建到表达载体pET28b(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MphR(A)和MphR(E)蛋白,然后用纯化蛋白建立大环内酯类抗生素检测的类ELISA系统。本实验比较了MphR(A)和Mph R(E)蛋白建立的类ELISA系统对各种大环内酯类抗生素的识别特异性。结果表明,各种大环内酯类抗生素在以MphR(A)和MphR(E)蛋白构建的系统中反应特性一致。但在目前的反应体系下,Mph R(A)蛋白比MphR(E)蛋白性能更优异。本研究确认Mph R(A)蛋白和MphR(E)蛋白不仅能够和自身对应的DNA序列结合,也可以和对方对应的DNA序列结合,且两个蛋白和DNA结合的特性接近。比较对应三段DNA序列,发现三段DNA序列均含有一段22bp长的不完全回文结构。通过实验基本确定这些不完全回文结构为蛋白结合的核心序列。采用不同的DNA序列构建系统,系统灵敏度有差异。用A-DNA或B-DNA构建系统的IC50为6.72±2.49 ng/mL(n=10),用C-DNA构建系统的IC50为3.95±1.18 ng/mL(n=10),而用AC4-DNA构建系统的IC50为2.33±0.70 ng/mL(n=7)。B-DNA的不完全回文序列(B5-DNA)和C-DNA的不完全回文序列(C6-DNA)用作系统中反应的DNA时,系统需要的蛋白浓度很高,而且系统背景值高,不合适目前体系下的类ELISA系统。根据类ELISA结果,推测蛋白和DNA的结合力对类ELISA系统灵敏度有影响,即在一定蛋白浓度范围内,蛋白和DNA结合力越低,系统灵敏度越高。采用生物膜干涉技术(BLI)初步测定了A-DNA、B-DNA、C-DNA、AC4-DNA与MphR(A)蛋白的亲和常数。结果表明A-DNA、B-DNA、AC4-DNA和蛋白的亲和力接近,C-DNA和蛋白的亲和常数较前三个DNA的低近一个数量级。利用MphR(A)和A-DNA作基础,采用蛋白和抗生素药物分步反应的方式,建立了原奶中红霉素残留的类ELISA系统。根据中国和欧盟残留限量规定计算所得系统的CCα值为43.28ng/mL,CCβ值为46.44ng/mL。该系统基本满足原奶实测样本需求,但要作为实际应用产品,还需要对该方法进一步研究,提高系统稳定性。
[Abstract]:MphR ( A ) and Mph R ( E ) proteins have been used to detect macrolide antibiotics .
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.8

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