芘和萘单克隆抗体的制备及免疫检测技术的研究

发布时间：2016-12-11 09:25

  本文关键词：芘和萘单克隆抗体的制备及免疫检测技术的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

芘和萘单克隆抗体的制备及免疫检测技术的研究

孟星宇  

【摘要】：多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）是一类由2个及2个以上苯环或戊环构成的多环类碳氢化合物的总称，是一类重要的环境和食品污染物，在大气、水、土壤等环境中普遍存在。有研究显示，PAHs可引发胃癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等疾病，同时破坏免疫系统、神经系统，并导致内分泌紊乱。动物实验表明，PAHs可诱发多种癌症，并造成机体的损伤。由于PAHs对人和动物危害较大，并且普遍存在于环境当中，已越来越多地受到人们的重视。因此，开展对PAH快速检测技术研究尤为重要。目前，常见的检测方法包括细胞检测法、薄层扫描法、分光光度法、气象色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、二极管矩阵检测法等。但是应用仪器分析和细胞检测方法需要较复杂的前期处理、较高的成本以及技术性较强专业人员，不利于检测方法的推广应用。而免疫学检测方法拥有特异性强，灵敏度高，操作简便，成本低等优点，可迅速对大量实际样品进行检测。本研究在制备芘和萘的免疫抗原、检测抗原和单克隆抗体基础上，分别建立了芘和萘的间接竞争ELISA方法、胶体金免疫层析方法、免疫荧光定量PCR方法（Real-time immuno-PCR，RT-IPCR）和改进型RT-IPCR方法，为快速检测PAHs含量奠定基础。 本文应用活脂法，将半抗原芘和萘分别连接至载体蛋白，制备检测抗原OVA-芘、OVA-萘和免疫抗原BSA-芘、BSA-萘，应用非变性凝胶电泳和紫外全波长扫描法鉴定偶联成功。将免疫抗原免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾细胞、腘淋巴结细胞和Sp2/0细胞融合，筛选杂交瘤细胞，获得2株可分泌芘单克隆抗体和萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。芘单克隆抗体和萘单克隆抗体亚型分别为IgG1和IgG3，亲和力常数分别为3.23×109L/mol和4.17×108L/mol，效价分别为1：2.56×106和1：3.2×105。 利用制备的芘和萘的单克隆抗体，分别建立相应的间接竞争ELISA检测方法，同时对检测方法进行条件优化。芘间接竞争ELISA最低检测限为65.08pg/mL，检测范围为117.16pg/mL～3986.97pg/mL，实际样品平均回收率为98.7±1.3%。萘间接竞争ELISA最低检测限为2.0ng/mL，检测范围为3.78ng/mL～172.33ng/mL，实际样品平均回收率为96.1±1.8%。 制备直径为20nm的胶体金溶液，分别于芘和萘的单克隆抗体偶联形成探针，透射电镜和紫外全波长扫描结果显示胶体金探针制备成功。组装简易试纸条后对各项参数进行优化。芘试纸条裸眼检测范围为10ng/mL～50ng/mL，萘试纸条检测范围为25ng/mL～125ng/mL，，在4℃真空干燥条件下，试纸条至少可以稳定保存8周。实际水样品加标回收实验表明，制备的胶体金试纸条性质稳定，可应用于实际样品。 利用芘和萘单克隆抗体，分别建立相应的免疫荧光定量PCR检测方法，同时对条件进行优化。芘RT-IPCR检测范围为100fg/mL～1ng/mL，实际样品平均回收率为98.6±4.1%。萘RT-IPCR检测范围为10pg/mL～10ng/mL，实际样品平均回收率为96.7±6.4%。 利用芘和萘单克隆抗体，分别建立相应的改进型RT-IPCR检测方法，同时对条件进行优化。芘改进型RT-IPCR检测范围为1pg/mL～1ng/mL，实际样品平均回收率为96.9±4.8%。萘改进型RT-IPCR检测范围为100pg/mL～100ng/mL，实际样品平均回收率为97.4±4.9%。 利用气谱-质谱联用法（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）分别建立萘、茐、菲、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[a]芘和茚并[1,2,3, cd]芘的标准曲线，确定最低检测限，将获得结果与前述建立的免疫学方法进行比较分析。结果表明，与GC-MS法相比，间接竞争ELISA法、RT-IPCR法、改进型RT-IPCR法灵敏度提高数十倍至数千倍。 综上所述，本文制备了芘和萘的单克隆抗体，并分别建立了间接竞争ELISA法、胶体金试纸条法、RT-IPCR法和改进型RT-IPCR法。同传统的GC-MS法相比，成本较低，灵敏度有不同程度的提高，可针对不同检测要求，选择应用。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4
【目录】：

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