猪Prdx6和Prdx2基因功能和转录调控分析

发布时间：2018-07-18 09:31

【摘要】：肌肉嫩度是影响肉质品质的重要因素,目前猪的育种工作将提高肌肉嫩度作为重要育种目标之一。然而作为肌肉嫩度重要的候选基因Prdx6和Prdx2影响嫩度的分子机制尚不清楚。本文主要研究这两个基因的转录调控,以及对肌肉、脂肪细胞分化的影响,从而探索其中的分子机制。主要的研究结果如下:(1)分析了猪Prdx6基因组织表达谱,通过5′RACE确定了猪Prdx6基因的转录起始位点,位于翻译起始位点上游65bp处的腺嘌呤位点,将该位点定义为+1。(2)克隆了猪Prdx6基因的5′端上游调控序列1684bp,利用生物信息学方法预测猪Prdx6启动子区,发现有很多转录因子结合,并且近端有4个GC-box。对得分较高的肌肉脂肪发育相关转录因子C/EBPβ、MyoD、CREB及GC-box上的Sp1结合位点进行多序列比对发现序列在不同物种中的保守性也很高。通过6段缺失载体的构建,转染三种真核细胞,确定了启动子的主要活性区域,然后通过该活性区域4段缺失载体的进一步构建,转染细胞,确定了该基因转录活性的最小单元为HSF结合位点。(3)将转录因子C/EBPβ、MyoD、CREB、Sp1和HSF1与相应的启动子载体共转染,确定了这些转录因子均能提高Prdx6启动子活性,并通过定点突变实验进行验证。超表达各个转录因子后采用定量和Western的方法验证转录因子和目的基因的表达量,确定了C/EBPβ和CREB能够促进Prdx6基因表达,干涉C/EBPβ和CREB可使Prdx6基因表达量下降。采用EMSA和ChIP实验验证了C/EBPβ和CREB能够结合到Prdx6基因的启动子区相应的转录因子结合位点。通过免疫沉淀实验发现转录因子C/EBPβ与Prdx6在蛋白水平互作,而CREB与Prdx6不存在互作关系。(4)分析了猪Prdx2基因组织表达谱,通过5′RACE确定了猪Prdx2基因的转录起始位点,位于ATG翻译起始位点上游70bp处的鸟嘌呤位点。克隆了猪Prdx2基因的5′端上游调控区域共计2360bp,通过生物信息学分析发现有许多转录因子结合位点,并存在TATA框和GC-box。通过9段缺失载体的构建,转染三种真核细胞,确定了启动子的主要活性区域,然后通过该活性区域4段缺失载体的进一步构建,转染细胞,确定了该基因的核心区域为TATA框。(5)通过定量的方法分析Prdx6和Prdx2基因在肌肉和脂肪细胞分化过程中的表达情况,确定了这两个基因与肌肉脂肪细胞的分化有关。采用定量和Western的方法验证了超表达和干涉Prdx6基因后对C2C12细胞分化标志基因的影响。(6)检测了C2C12细胞分化不同时期细胞内活性氧的含量发现ROS水平随细胞分化而逐渐升高。体外添加抗氧化剂NAC可以降低细胞分化中产生的ROS。通过超表达使内源抗氧化物Prdx6水平升高也可以降低ROS含量,干涉使细胞内Prdx6水平降低会使细胞ROS水平升高。本研究分析了嫩度候选基因Prdx6和Prdx2的基础转录调控机制,提出Prdx6基因通过与C/EBPβ互作或通过调控活性氧水平参与调控脂肪或肌肉发育的分子机制,为进一步研究这两个基因在肌肉脂肪发育过程中的作用提供理论基础。
[Abstract]:Muscle tenderness is an important factor affecting the quality of meat quality. At present, pig breeding will improve muscle tenderness as one of the important breeding targets. However, as a candidate gene, Prdx6 and Prdx2, an important candidate for muscle tenderness, the molecular mechanism of tenderness is not clear. This paper mainly studies the transcription regulation of these two bases, and the muscle and fat thin. The molecular mechanism of cell differentiation was explored. The main results were as follows: (1) the tissue expression profiles of porcine Prdx6 gene were analyzed, and the transcriptional starting site of the pig Prdx6 gene was determined by 5 'RACE, and the adenine site at the upstream of the translation start site was located, and the site was defined as +1. (2) cloned the 5' end of the pig Prdx6 gene. The upstream regulatory sequence 1684bp, using bioinformatics to predict the pig Prdx6 promoter region, found a number of transcription factors binding, and 4 GC-box. near the proximal end of the muscle fat development related transcription factor C/EBP beta, MyoD, CREB, and GC-box Sp1 binding sites were found to have multiple sequence alignment in different species. Through the construction of 6 deletion vectors, three eukaryotic cells were transfected to determine the main active region of the promoter, and then through the further construction of the 4 segment deletion vector of the active region, the transfected cells were transfected, and the minimum unit of the transcriptional activity was determined to be HSF binding site. (3) the transcription factor C/EBP beta, MyoD, CREB, Sp1 and HSF1 Co transfection with the corresponding promoter, determined that these transcription factors could improve the activity of Prdx6 promoter and verified by site directed mutagenesis. After overexpression of various transcription factors, quantitative and Western methods were used to verify the expression of transcription factors and target genes, and that C/EBP beta and CREB could promote the expression of Prdx6 genes. The interference of C/EBP beta and CREB could decrease the expression of Prdx6 gene. The EMSA and ChIP experiments showed that C/EBP beta and CREB could bind to the corresponding transcription factor binding site of the promoter region of the Prdx6 gene. The interaction of the transcription factor C/EBP beta and Prdx6 at the protein level was found by the immunoprecipitation experiment, while CREB was not interacted with Prdx6. (4) analysis. The expression profile of porcine Prdx2 gene was determined by 5 'RACE, and the transcriptional starting site of the pig Prdx2 gene was located at the guanine loci in the upstream of the ATG translation start site. A total of the upstream regulation region of the 5' terminal of the pig Prdx2 gene was cloned, and a number of transcription factor binding sites were found by bioinformatics analysis, and the TATA frame was found. And GC-box. transfection of three eukaryotic cells through the construction of 9 deletion vectors, determined the main active region of the promoter, and then transfected cells through the further construction of the 4 segment deletion vector of the active region, and determined the core region of the gene as TATA frame. (5) the Prdx6 and Prdx2 genes were analyzed by quantitative method in muscle and fat cells by quantitative method. In the process of differentiation, the two genes were determined to be related to the differentiation of muscle fat cells. Quantitative and Western methods were used to verify the effect of overexpression and interference of Prdx6 gene on the differentiation marker genes of C2C12 cells. (6) the content of reactive oxygen species in cells of different stages of differentiation of C2C12 cells was detected and the ROS level was found with the cells. The addition of antioxidant NAC in vitro can reduce the ROS. produced in cell differentiation through overexpression and increase the level of endogenous antioxidant Prdx6 and reduce ROS content. Interference causes the decrease of Prdx6 level in cells to increase the level of cell ROS. This study analyzed the basic transcriptional modulation of the candidate gene for tenderness, Prdx6 and Prdx2. Control mechanisms suggest that Prdx6 gene provides a theoretical basis for further study of the role of these two genes in the development of muscle fat by interacting with C/EBP beta or by regulating reactive oxygen species (ROS) and regulating the molecular mechanisms of fat or muscle development.
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828

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本文编号：2131488