miRNA160通过SIARF10对番茄叶片失水和果实发育的调控作用

发布时间：2018-08-04 20:52

【摘要】：生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)作为一类转录因子,通过调控下游基因表达参与植物诸多生理生化进程。而ARF的转录水平却受miRNA的调控。基于前人和课题组的研究基础,初步明确了番茄miRNA160可调控靶基因SIARF10、SIARF16和SIARF17,miRNA167可调控slARF6和slARF8。本研究为进一步明确miRNA160和miRNA167调控靶基因AREs参与番茄生长发育的功能,利用35S::mSIARF10-6(抗miRNA160降解的形式)转基因材料探讨了miRNA160调控SIARF10对番茄叶片失水速率的影响,并明确了ARF10通过直接影响气孔发育和水通道蛋白表达而增加番茄叶片的水分导度；而利用dgt,gib-3突变体研究了ARFs/miRNAs在番茄果实发育早期果皮发育的作用,初步探讨了受miRNA160和miRNA167调控的ARFs可能协同生长素和赤霉素调控果皮的细胞分裂和膨大：根据构建并获得的超表达miRNA160的转基因植株及T1代,初步发现miRNA160调控的ARFs对番茄叶片有重要的调控作用。这些研究将为进一步明确ARF/miRNA的生物学调控机制和生长素调控植物生长发育的作用机理奠定基础。主要研究结果如下：1.采用mSIARF10过表达转基因番茄(抗miR160降解)叶片进行表型分析发现,其叶片显著变窄(长/宽),气孔变大,气孔密度变小。通常窄叶片具有较小的失水速率,然而与野生型相比,35S:mSIARF10-6的离体叶片表现出更大的叶片失水速率。在水分胁迫处理过程中,35S:mSIARF10-6积累了更高的ABA含量,而对于外源ABA影响其气孔的敏感度显著高于野生型。但进一步分析表明35S:mSIARF10-6实际的叶片失水率与依靠气孔水蒸气散失的计算失水率不同,这表明了还有其他方式影响35S:mSIARF10-6叶片失水。进一步利用水通道蛋白(aquaporins,AQPs)抑制剂HgCl2处理证实35S:mSIARF10-6有较高的AQP活性,具有更高的水力导度。以上结果表明35S:mSIARF10-6失水率的提高是气孔和水通道蛋白活性共同作用的结果。2.根据RNA-sequencing表明在35S:mSIARF10-6中有5个AQP家族基因,14个ABA合成与信号转导相关基因以及3个气孔发育相关基因表达水平发生显著变化,其中SIABI5具有ABA依赖的转录因子活性。对上调表达的AQP基因的启动子分析表明,上调的AQP基因启动子均包含ABRE或AuxRE启动子元件。挑选上调表达最显著的三个基因(SITIP1-1,SIPIP2;4和SINIP-type like)进行启动子活性分析试验发现,包含AuxRE元件的SIPIP2;4和SINIP-like的启动子区域以及包含ABRE元件的SIPIP2;4和SITIP1;1启动子区域在35S:mSIARF10-6转基因材料中GUS酶活性显著增强。EMSA和酵母单杂交试验证实,SIARF10可以与AQP基因启动子中的AuxRE启动子元件结合。而将35S:mSIARF10-6中表达量显著提高的转录因子SIAB15进行酵母单杂交,证实可与AQP基因启动子中的ABRE启动子元件结合。因此35S:mSIARF10-6的AQP表达增强可能是ARF10和ABI5上调表达的结果。然而,通过SIARF10沉默与SIABI5超表达的瞬时表达发现,下调SIARF10可以降低番茄叶片失水率,超表达SIABI5在水分胁迫处理前6h显著下调失水率,因此35S:mSIARF10-6的高失水率不是由于SIABI5的作用,而是SIARF10直接作用的结果。本研究表明,尽管SIARF10通过增加ABA合成与信号响应通过调控气孔开度来降低水分缺失,但SIARF10通过影响气孔发育和水通道蛋白活性来加速水分散失。因此miR160调控的SIARF10对于维持叶片的水分平衡有着重要意义。3.利用外源IAA喷施番茄GA缺失突变体(gib-3)以及外源GA喷施番茄IAA信号途径受阻突变体(dgt)果实材料。解剖结果表明IAA导致果皮增厚,果皮细胞层数增加,而GA并没有增加果皮细胞层数；RT-PCR研究发现,IAA处理gib-3突变体后SIARF6,SIARF8,SIARF10和SIARF16表达水平显著下调,而miR160和miRl67显著上调；而dgt突变体中SIARF6,SIARF8,SIARF10和SIARF16表达水平受到GA影响显著上调,而miRNAs表达水平显著下调。这些结果表明了在番茄果实发育初期,SIARF6, SIARF8,SIARF10和SIARF16的表达与果皮细胞层数呈负相关。进一步利用35S:mSIARF10-6转基因番茄植株进行果实果皮分析,结果表明mSIARF10过表达使坐果期果皮细胞层数显著降低。以上结果表明GA和IAA介导的miRNAs及其靶基因ARFs可能参与番茄果实发育早期的果皮细胞增殖过程。4.利用Gateway技术成功构建了miRNA160超表达载体。将番茄miRNA160前体连入具有强启动子的pB7WG2D,1载体。通过优化的番茄遗传转化体系成功获得番茄转基因植株。并通过荧光检测,分子及蛋白水平等鉴定方法成功验证了T1代转基因植株番茄。对转基因番茄植株进行表型分析,发现35S::SImiR160转基因植株的表型：叶片宽度增大,叶裂减少,叶面积增大等。暗示了miR160对番茄叶片发育的重要调控作用。为一进步探究miRNA160对番茄的生长发育机制提供了优良试材。
[Abstract]:Auxin response factor (ARF), as a class of transcription factors, participates in many physiological and biochemical processes in plants by regulating downstream gene expression, and the transcriptional level of ARF is regulated by miRNA. Based on the research basis of previous and subject groups, the target gene SIARF10 of tomato miRNA160, SIARF16, SIARF17, miRN, is preliminarily clarified. A167 can regulate slARF6 and slARF8. in this study to further clarify the function of miRNA160 and miRNA167 regulating target gene AREs to participate in tomato growth and development. Using 35S:: mSIARF10-6 (the form of anti miRNA160 degradation), the effect of SIARF10 on the rate of water loss in tomato leaves was investigated, and the direct influence of ARF10 on the gas was determined. The water conductivity of tomato leaves was increased by pore development and aquaporin expression, and the effect of ARFs/miRNAs on the development of fruit peel in the early stage of tomato fruit development was studied by using DGT and gib-3 mutants. The cell division and expansion of ARFs regulated by miRNA160 and miRNA167 was preliminarily discussed in the regulation of auxin and gibberellin. The transgenic plants and T1 generation of the overexpression of miRNA160 have been obtained. It is found that the ARFs regulated by miRNA160 plays an important role in regulating the leaves of tomato. These studies will lay a foundation for further clarifying the biological regulation mechanism of ARF/miRNA and the mechanism of the growth and development of plants by auxin. The main results are as follows: 1. the use of mS The phenotypic analysis of IARF10 overexpressed transgenic tomato (anti miR160 degradation) leaves showed that the leaves were significantly narrower (long / wide), the stomata became larger, and the stomatal density became smaller. Usually narrow leaves had smaller water loss rates. However, compared with the wild type, the leaves of the 35S:mSIARF10-6 leaves showed greater leaf loss rate. During the process, 35S:mSIARF10-6 accumulated a higher ABA content, but the sensitivity of the exogenous ABA to the stomata was significantly higher than that in the wild type. However, the further analysis showed that the actual loss rate of the 35S:mSIARF10-6 leaves was different from that of the calculated water vapor loss depending on the pore water vapor loss. This indicates that there are other ways to influence the water loss of the 35S:mSIARF10-6 leaves. One step using aquaporins (AQPs) inhibitor HgCl2 treatment confirmed that 35S:mSIARF10-6 had higher AQP activity and had higher hydraulic conductivity. The above results showed that the increase of 35S:mSIARF10-6 water loss rate was the result of the co action of stomata and aquaporin activity,.2. based on RNA-sequencing showed that there were 5 AQP in 35S:mSIARF10-6. Family genes, 14 ABA synthesis and signal transduction related genes and 3 stomatal development related genes have significant changes, in which SIABI5 has ABA dependent transcription factor activity. The up-regulated AQP promoter analysis showed that the up regulation of AQP gene promoter contained ABRE or AuxRE promoter components. The promoter activity analysis test of the most significant three genes (SITIP1-1, SIPIP2; 4 and SINIP-type like) found that SIPIP2 containing AuxRE elements, the promoter region of 4 and SINIP-like, and SIPIP2, 4 and SITIP1 containing ABRE elements; 1 promoter region significantly enhanced the activity of the GUS enzyme activity in the 35S:mSIARF10-6 transgenic material and the yeast single The hybridization test confirmed that SIARF10 could be combined with the AuxRE promoter element in the AQP gene promoter, and the yeast single hybridization was carried out with the transcriptional factor SIAB15, which was significantly increased in the 35S:mSIARF10-6 expression, and proved to be associated with the ABRE promoter element in the AQP gene promoter. Therefore, the enhancement of 35S: mSIARF10-6 AQP expression may be on ARF10 and ABI5. However, through the transient expression of SIARF10 silencing and SIABI5 overexpression, it was found that down-regulation of SIARF10 could reduce the water loss rate of tomato leaves, and the overexpression of SIABI5 was significantly down regulated by 6h before water stress treatment. Therefore, the high water loss rate of 35S:mSIARF10-6 was not due to the effect of SIABI5, but the result of SIARF10's direct effect. It is shown that, although SIARF10 reduces water loss by regulating stomatal opening by increasing ABA synthesis and signal response, SIARF10 accelerates water loss by affecting the stomatal development and aquaporin activity. Therefore, miR160 regulated SIARF10 is of great significance for maintaining the water balance of leaves.3. using exogenous IAA to spray tomato GA deficiency. The loss of mutant (gib-3) and exogenous GA spraying tomato IAA signal pathway blocked mutant (DGT) fruit material. The anatomical results showed that IAA resulted in the thickening of the peel and the increase of the number of cells in the pericarp, while GA did not increase the number of cell layers. The RT-PCR study found that IAA treated gib-3 mutants as SIARF6, SIARF8, SIARF10, and expression levels decreased significantly. The expression level of SIARF6, SIARF8, SIARF10 and SIARF16 in DGT mutants was significantly up-regulated by GA, and the expression level of miRNAs decreased significantly in DGT mutants. These results showed that the expression of SIARF6, SIARF8, SIARF10, and SIARF6 was negatively correlated with the number of peel cell layers in the early stage of tomato fruit development. The fruit peel analysis of mSIARF10-6 transgenic tomato plants showed that over expression of mSIARF10 resulted in a significant decrease in the number of cell layers in fruit peels. The above results showed that miRNAs and the target gene ARFs mediated by GA and IAA may participate in the proliferation of fruit cells in the early stage of tomato fruit development.4. using Gateway technology to successfully construct miRNA160 super. The expression vector. The tomato miRNA160 precursor was joined with the strong promoter pB7WG2D, 1 carrier. The tomato transgenic plants were successfully obtained through the optimized tomato genetic transformation system. The transgenic tomato plants of the T1 generation were successfully verified by the fluorescence detection, molecular and protein level and other identification methods. The phenotype of 35S:: SImiR160 transgenic plants: the widen leaf width, the decrease of leaf cleft and the increase of leaf area. It suggests that miR160 plays an important role in regulating the development of tomato leaves. It provides a good test for the research of the mechanism of miRNA160 for the growth and development of tomato.
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S641.2

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