番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用

发布时间：2018-10-08 17:57

【摘要】：番木瓜(Carica papaya L.)是海南重要热带经济果树之一,除了番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)和番木瓜花叶病毒(Papaya mosaic virus, PaMV)对番木瓜种植造成严重的病害之外,本研究于2012年首次在海南东方市转基因抗PRSV的番木瓜植株上,发现一种新的危害番木瓜栽培的番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leafdistortion mosaic virus, PLDMV)。以上三种病毒在番木瓜上的病症极为相似,在田间难以通过症状表现进行鉴别,给防治工作带来极大的困难。为此,本研究建立了灵敏快速检测这三种病毒的反转录-环介导等温扩增(Reverse transcription loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP)和多重RT-PCR的方法。目前,对PLDMV的致病机理的研究较少,而植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒基因功能的重要工具。本研究通过对PLDMV海南东方市分离物(PLDMV-DF)全长基因组序列进行测定并对其分子特征进行生物信息学分析,并成功构建了可系统侵染番木瓜的PLDMV-DF全长cDNA克隆和表达GFP的PLDMV-DF病毒表达载体,为进一步研究该病毒基因功能、病症发生及病毒致病机理奠定了基础。另外,利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体,为后续进行转基因抗PLDMV研究奠定了基础。 主要研究结果如下： (1) PLDMV的发现与寄主范围 本研究首次在中国大陆报道发现了PLDMV,对其寄主范围鉴定发现PLDMV-DF既能侵染转基因抗PRSV番木瓜也能侵染非转基因番木瓜,但不能侵染西葫芦(Cucurbita pepo)和本生烟(Nicotiana benthamiana). (2)克隆了PLDMV-DF分离物全长基因组序列 PLDMV-DF分离物全长基因组序列由10153nt组成(GenBank登录号：JX974555)。5’端和3’端UTR分别为134nt和209nt,含一个编码3269个氨基酸的多聚蛋白和一个编码75个氨基酸的小ORF。与日本J56P、台湾KS和CZ分离物的全长核苷酸序列相似性为94.3%-94.9%,氨基酸序列相似性为95.9%-96.3%。核苷酸及氨基酸序列的进化树分析显示,PLDMV-DF分离物与日本J56P分离物为一支,表明PLDMV-DF分离物与地理位置相对较远的日本分离物J56P可能具有共同的进化起源。 (3)建立了RT-LAMP和多重RT-PCR检测方法 成功建立了检测PLDMV、PRSV和PaMV三种病毒的RT-LAMP可视化检测体系和同时检测这三种病毒的多重RT-PCR检测方法。利用多重RT-PCR对海南岛内番木瓜病毒病害发病生态进行调查发现,PRSV、PLDMV和PapMV的发病率分别为：54.5%,27.3%和0.9%,而且首次发现PRSV和PLDMV存在混合感染的现象17.3%。 (4)利用In-Fusion融合的方法快速获得PLDMV-DF的全长cDNA侵染性克隆,成 功地通过体外转录获得了具有侵染活性的病毒RNA转录本 为了克服其在E.coli细胞中的不稳定性,本研究采用插入内含子intron2和intron IV2的策略[内含子intron2插入到P3(第3709/3710nt)区域；intron IV2插入到CI(第5028/5029nt)区域；内含子intron2和intron IV2分别插入到P3(第3709/3710nt)和CI(第5028/5029nt)区域],成功构建了2个侵染性克隆：pT7-FL-In2(内含子intron2插入到P3(第3709/3710nt)区域)和PT7-FL-In2/IV2(内含子intron2和intron IV2分别插入到P3(第3709/371011t)和CI(第5028/5029nt)区域)。pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2体外转录产物接种番木瓜都表现出系统性侵染,未添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率达到58.8%-61.1%,而添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率高达73.7%-75.0%。 (5)利用酵母同源重组系统,建立了一种改良的快速构建植物病毒侵染性克隆的方法,成功地通过农杆菌接种获得了具有侵染活性的PLDMV-DF侵染性克隆 本实验对酵母同源重组系统方法进行改进,成功构建了两种适用农杆菌侵染法接种的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2(内含子intron2插入到P3(第3709/3710nt)区域),共获得4个农杆菌克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34和p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3。以上4个克隆与构建的PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体pBI121-HC-Pro混合接种番木瓜植株的侵染效率(85.7%-91.4%)比单独接种的侵染效率(64.7%-69.4%)高,而且能提前2-3天表现出症状。 (6)利用改良的酵母同源重组系统,将PLDMV-DF改造为病毒表达载体,在番木瓜中GFP获得系统性表达 利用改进后酵母重组方法,成功构建了在PLDMV-DF的P1与HC-Pro之间和NIb与CP之间插入gfp外源基因的病毒表达载体P35S-FL-P1/GFP-8、p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-P1/GFP-In2-5、p35S-FL-GFP/CP-23-1、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2。GFP获得系统性表达的克隆为p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2,侵染效率达73.5%-93.9%,在共聚焦荧光显微镜和UV灯下都能检测到GFP发光,,western blot检测到GFP表达。而p35S-FL-P1/GFP-9的位点突变影响其病症,可能突变为弱毒株,可用于交叉保护防治PLDMV。而p35S-FL-GFP/CP-23-1的位点突变影响GFP表达,但不影响其侵染性(66.7%),但病症延迟30-40天。在接种90天后,gfp报告基因从插入位点会发生丢失现象。 (7)利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体 利用OZ-LIC法,成功构建了4种不同CP基因片段长度的ihpRNA植物表达载体pRNAi-CP879、pRNAi-CP400、pRNAi-CP326和pRNAi-CP140。在接种克隆p35S-FL-GFP/CP-38-1的番木瓜原生质体中,通过共聚焦荧光显微镜和RT-PCR分析,快速验证出pRNAi-CP879、pRNAi-CP400和pRNAi-CP326有较高的沉默效率
[Abstract]:......
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.67
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本文编号：2257728