中黑盲蝽信息素合成相关基因的筛选及功能分析

发布时间：2018-10-09 11:55

【摘要】：信息素是昆虫化学交流的重要媒介物质,对物种的生存和发展具有重要的意义。近几十年来,解密其功能,生物合成路径、分子机制以及演化过程,引起了人们极大的兴趣。目前,鳞翅目昆虫信息素的生物合成分子机制已逐渐清晰,鞘翅目以及双翅目昆虫信息素的生物合成路径也有一定的研究。相比之下,在半翅目昆虫中,其信息素的生物合成分子机制尚未见报道。本研究以棉花上的重要害虫中黑盲蝽为研究对象,构建了中黑盲蝽后胸臭腺转录组数据库,筛选了不同实验条件下稳定表达的内参基因,利用RNA-Seq技术获得了在信息素释放高峰期雌虫后胸臭腺内高表达的差异基因,最后结合实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和RNA干扰(RNA interference,RNAi)首次对中黑盲蝽信息素合成相关基因进行筛选和功能分析。主要结论如下:1中黑盲蝽后胸臭腺转录组Unigene数据库构建中黑盲蝽Adelphocoris suturalis为非模式昆虫,其基因组资源的缺乏限制了对其各种生理生化过程分子机制的研究。本研究通过对中黑盲蝽后胸臭腺进行转录组测序,共获得了52,067,950条长度为91 bp的Clean Reads,进一步组装成70,296条Unigenes,其中26,744(38%)条Unigenes能够有效的匹配(E-value10-5)NCBI数据库中的已知蛋白。有9,258个注释序列通过同源基因聚类分析(COG)归属于25个不同的生物学功能。16,473条Unigenes分别归类于242个KEGG代谢路径。通过生物信息学分析,筛选出了818条的信息素合成相关候选基因。该结果为探索中黑盲蝽信息素合成的分子机制提供了基础分子资源。2中黑盲蝽实时定量PCR内参基因的筛选在利用RT-qPCR技术分析基因的表达过程中,选择合适的内参基因来均一化不同样品之间的差异是最基本的要求。然而,目前没有文献对中黑盲蝽内参基因的稳定性进行描述。本章节评价了12个半翅目昆虫常用的内参基因(GAPDH、ACT、βACT、TBP、SDH、βTUB、EF1γ、EF1α、EF1d、RPL32、RPS15和RPL27)在不同的实验条件下的表达稳定性。BestKeeper、ge Norm、NormFinder、ΔCt和RefFinder被用于计算各候选内参基因的稳定值。结果推荐EF1γ、EF1d和RPS15作为中黑盲蝽各生理过程基因表达分析最稳定的内参基因。3 RNA-Seq和RNAi筛选中黑盲蝽信息素合成相关基因以前期构建的中黑盲蝽后胸臭腺转录组数据库为基础,利用RNA-Seq技术构建了4个中黑盲蝽不同发育阶段和性别后胸臭腺即1日龄雌虫后胸臭腺(1d FMTG)、1日龄雄虫后胸臭腺(1d MMTG)、8-11日龄雌虫后胸臭腺(8-11d FMTG)和8-11日龄雄虫后胸臭腺(8-11d MMTG)的表达文库,均获得了超过6.9×10-6的Clean Reads。差异比较分析结果显示,在不同发育阶段及性别的臭腺之间差异表达的基因数目在3,350-12,834之间。RT-qPCR验证结果显示DesB、AOX、FAR和一些ATF均在雌虫性信息素释放高峰期的后胸臭腺内高表达。因此,我选择了DesB、AOX、FAR以及ATF中差异表达最显著的N-ATF10作为候选基因进行下一步的RNAi实验,以验证其是否参与了中黑盲蝽信息素的生物合成。结果表明只有沉默DesB基因的表达显著抑制了雌虫对雄虫的引诱能力,这可能预示着DesB与中黑盲蝽信息素的生物合成相关。4基于RNAi的Des B基因功能验证在许多昆虫中,Desaturases是催化信息素组分双键形成的关键酶类。前期的研究结果表明,沉默DesB基因的表达显著抑制了雌虫对雄虫的引诱能力,因此我们推测DesB可能参与了中黑盲蝽的信息素合成。为了验证这一假设,我们从中黑盲蝽中分离鉴定出了两个DesaturasesB基因全长序列,并命名为Desaturase B1(DesB1)和Desaturase B2(DesB2)。序列分析结果显示,DesB1和DesB2享有共同的开放阅读框,其序列差异仅在5端非编码区。Southern blot分析结果表明,DesB1和DesB2属于两个独立的基因。组织表达分析结果显示,在所有的五个测试组织中,DesB2的转录丰度均显著高于DesB1,尤其是在后胸臭腺中。室内Y型嗅觉仪以及田间诱捕实验进一步验证了DesB基因表达的下调显著抑制了雌虫性引诱能力。通过GC-MS分析DesB基因表达的下调对中黑盲蝽信息素滴度的影响,结果显示抑制Des B基因的表达,显著增加了中黑盲蝽信息素组分之一4-氧代-反-2-己烯醛的含量,改变了性信息素组分的混合配比。5中黑盲蝽的卵巢发育及繁殖能力的必须基因——FAR在许多昆虫中(例如,鳞翅目和双翅目),Fatty acyl-CoA reductase(FAR)是催化信息素含氧官能团形成的关键酶类。在本章中,我们克隆获得了一个中黑盲蝽的FAR基因全长序列。时空表达模式分析结果显示,FAR在中黑盲蝽的卵巢内高表达,并且随着卵巢的发育呈上升的趋势。RNAi验证结果显示,沉默FAR基因的表达显著减少了中黑盲蝽卵母细胞的数量和卵巢的干重,抑制了雌虫的繁殖力和卵的孵化率,最终导致雌虫产生少量可存活的后代。结果表明FAR在中黑盲蝽繁殖中起到了重要的作用。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433

【参考文献】