【摘要】：真菌毒素具有较强的毒性,主要污染玉米、小麦等饲料原料,且污染范围广泛,严重危害着畜牧业的发展和人类的健康。建立高灵敏度、快速、高通量的免疫学分析方法是保障畜禽和人类不受真菌毒素危害的重要技术手段。高亲和力族特异性抗体是建立免疫学分析方法的关键;双波长荧光偏振免疫分析方法(Double-Wavelength Fluoresence polarization immunoassay,DWFPIA)是提高检测通量的有效方法;新型环境友好型纳米材料的使用是提高侧流层析免疫分析方法(Lateral flow immunoassay,LFA)灵敏度的重要途径。因此,本论文旨在制备高灵敏度和族特异性的抗体,建立高通量、多靶标同时检测的FPIA和LFA,为真菌毒素的监控提供方法手段。同时使用多种低亲和力的竞争物,设计筛选策略,突破了高亲和力和交叉反应率均匀的族特异性抗体不能同时获得的技术瓶颈,制备了高亲和力和交叉反应率均匀的族特异性黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)5H3和玉米赤霉烯酮类化合物(Zearalenones,ZENs)mAb3D4,mAb5H3 针对黄曲霉毒素 B1(AflatoxinB1,AFB1)的 IC50值是 0.0928ng/mL,与黄曲霉毒素 B2(AflatoxinB2,AFB2)、黄曲霉毒素 G1(AflatoxinG1,AFG1)、黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2,AFG2)、黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)和黄曲霉毒素M2(AflatoxinM2,AFM2)的交叉反应率(cross-reactivity,CR)分别是 80.1%、133.7%、81.6%、94.2%和60.9%;mAb 3D4针对玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的IC50值是0.041 ng/mL,与玉米赤霉酮(Zearalanone,ZAN)、α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenone,α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalenone,β-ZOL)、α-玉米赤霉醇(α-Zearalanone,α-ZAL)和 β-玉米赤霉醇(β-Zearalanone,β-ZAL)的 CR分别是66%、107.9%、57.2%、103.5%和73.9%;经过盲筛策略,制备了高灵敏度的呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)的 mAb12E8,针对 DON 的 IC50值是 2.95ng/mL,与 3-乙酰-呕吐毒素(3-acetyl-deoxynivalenol,3-Ac-DON)和15-乙酰-呕吐毒素(15-acetyl-deoxynivalenol,15-Ac-DON)的CR分别是2681%和23%;此外,经过特异性筛选策略,制备了高特性性的T-2毒素(T-2 toxin,T-2)的 mAb 9C7,针对 T-2 的 IC50 值是 1.12 ng/mL。采用光谱分辨技术,以荧光标记物AFB1-EDF和mAb 5H3与ZAN-TRCA和mAb 3D4为最佳荧光标记物-抗体组合,建立了同时识别AFs和ZENs的DWFPIA,该方法对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2等质量混合标准品IC50值2.68 ng/mL,对玉米样本最低检测限(limit of detection,LOD)是 4.98μg/kg;对 ZEN,ZAN,α-ZAL,β-ZAL,α-ZOL 和 β-ZOL 等质量混合标准品的 IC50值是4.08 ng/mL,玉米样本中的LOD是11.03 μg/kg;添加回收率在78.6-103.6%之间,变异系数(coefficients of variation,CV)小于 19.2%。合成了不规则碳纳米粒子(Amorphous carbon nanoparticles,ACNPs),建立了同时检测DON、T-2和ZEN的ACNPs-LFA分析方法。在缓冲液中,灵敏度比胶体金提高了 8倍,与量子点的灵敏度相当;在玉米样本中可视化检测限(visual limit of detection,vLOD)分别是300、150和15μg/kg;定量检测限(quantitative limit of detection,qLOD)分别是 19.8、12.9 和 1.04 μg/kg,IC50值分别是 63.3、25.2 和 3.87 μg/kg;添加回收率分别为 87.6-109%,84.6-92.5%和 86-92.5%,CV均小于11.6%;在自然发生真菌毒素污染的玉米样本中,其检测结果与HPLC-MS/MS的检测结果相关性良好。综上所述,本研究制备的高灵敏和族特异性的抗体用于高通量、多靶标同时检测AFs和ZENs的DWFPIA以及同时检测DON、T-2和ZEN的ACNPs-LFA,能够满足这些真菌毒素现场检测的要求。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.8
【参考文献】
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2263607
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