高温高湿下GmBLH4参与春大豆种子田间劣变抗性的分子机制研究

发布时间：2018-10-10 13:31

【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是重要的油料作物,也是我国的战略性物资,在我国种植业结构调整和民族种业发展中占有重要地位。我国南方春大豆种子生理成熟期往往会遇到高温多雨的夏季,导致种子发生田间劣变,严重影响了春大豆的产量和品质。植物转录因子(如TALE家族的两个成员KNOTTED-like homeobox (KNOX)和 BEL1-likehomeobox (BELLorBLH))在植物生长发育以及应答生物和非生物胁迫过程中具有重要的作用。实验室前期研究发现,大豆KNOX家族成员GmSBH1能够参与调控植株的幼苗形态建成、生长发育以及种子田间劣变抗性过程。本文拟以田间劣变抗性品种湘豆3号的大豆种子为材料,构建高温高湿酵母双杂交cDNA文库;以GmSBH1蛋白为诱饵,筛选出15个与种子田间劣变相关的互作蛋白;利用GST pull-down和双分子荧光互补(BiFC)技术分别从体外和体内验证大豆BELL家族转录因子GmBLH4与GmSBHl的互作关系;通过系统进化分析、蛋白质结构和功能分析初步明确了 BELL家族在大豆发育过程中的作用和进化特点;利用荧光定量、亚细胞定位、启动子分析以及转基因功能验证等技术阐明了GmBLH 基因参与植物形态建成以及种子田间劣变过程,为大豆TALE家族参与种子田间劣变抗性的调控网络研究提供理论依据。主要研究结果如下:1、以田间劣变抗性品种湘豆3号为材料,采用同源重组的方法,构建大豆生理成熟期(R7期)高温高湿(40×2℃/30±2℃、相对湿度95±5%昼/70±5%夜、10 h昼/14h夜)酵母双杂交cDNA文库,文库多样性和均一性均较好,文库效率大于1.0×106,适合用于蛋白与蛋白之间相互作用的大规模筛选。2、以实验室前期分离并鉴定的种子田间劣变相关转录因子GmSBH1为诱饵蛋白,与1中的酵母cDNA文库进行双杂交,通过营养缺陷型培养基和X-gal染色共筛选到49个阳性克隆;提取49个阳性克隆的质粒并转化大肠杆菌,扩繁后进行测序和比对,得到15个可能与GmSBH1互作的蛋白;利用NCBI数据库和UniProt蛋白数据库检索15个互作蛋白的功能,分别为种子成熟蛋白、种子贮藏蛋白、发育相关蛋白、蛋白酶抑制剂和功能未知蛋白。3、从15个互作蛋白中挑选植物发育相关基因召EL1-LIKE HOMEODOMAIN 4 (GmBLH4),进化树分析表明大豆基因组中含有34个BELL家族基因,并且发现GmBLH4和拟南芥中的BLH4(SAW2)同源性较高;基因表达谱分析显示GmBELLs在大豆叶片、根、茎、花、荚、根瘤、根毛、种子和顶端分生组织(SAM)中差异表达;根据NCBI和Phytozome数据库提交的GmBLH4的CDS序列,从大豆cDNA中分离出其完整编码区域,序列分析显示该基因的ORF全长2022bp,编码674个氨基酸;蛋白质结构域分析显示其蛋白包含SKY结构域、典型的BEL保守域结构以及Homeodomain结构域;Signa1P网站预测显示GmBLH4不具有信号肽;二级结构预测显示,GmBLH4序列存在α-螺旋(38.58%)、β-转角(6.68%)、延伸链(10.39%)和无规卷曲(44.36 %);基于烟草表皮细胞和大豆原生质体转化体系的亚细胞结构定位表明,GmBLH4定位于细胞核中。4、利用双分子荧光互补实验(BiFC)和GST pull-down以及Western blot技术验证,无论体内还是体外GmBLH4蛋白都能特异地结合GmSBH1蛋白。5、GmBLH4与GmSBH1互作关系与特点的研究结果表明,GmSBH1的保守结构域 MEINOX (KNOX1 和 KNOX2)和 Homeodomain 都能够结合 GmBLH4蛋白,但是GmSBHl编码区完整存在时的活性最高;GmBLH4蛋白中N端(包含SKY和BEL结构域)和C端(Homeodomain结构域)也有利于其结合GmSBHl蛋白。以上结果说明TALE家族的保守域对于KNOX/BELL二聚体的形成很重要。6、GmBLH4基因在大豆中的组织特异性表达结果表明,无论是抗性品种湘豆3号还是不抗品种宁镇1号,GmBLH4基因均在花中表达量最高,根中次之,种子表达量最低。启动子驱动下的GUS基因染色结果显示,GmBLH4在拟南芥的花、幼苗的根和顶端分生组织中高表达,在荚、成熟叶片及种子中不表达。高温高湿胁迫下,GmBLH4基因在宁镇1号中胁迫处理48h后显著上调表达,而在湘豆3号中处理168 h后表达才能达到显著水平。以上结果说明GmBLH4基因可能参与调控大豆顶端分生组织和花器官的生长发育,同时也可能参与春大豆种子田间劣变过程。7、异源表达结果表明,GmBLH4基因过表达导致拟南芥叶片卷曲、角果变短以及产量降低等。石蜡切片结果显示转基因植株叶片的细胞排列松散、细胞间隙较大,栅栏细胞变短变细,海绵细胞分布不规则,近、远轴细胞尤其是远轴细胞变得更小、排列更加紧密。转GmBBLH4基因株系经高温高湿胁迫后,种子发芽率和生活力明显高于野生型和突变体blh4植株,与转GmSBH1基因株系种子的耐逆性相当。以上结果表明GmBLH4能够与GmSBHl形成异源二聚体,并参与影响植物叶片的正常发育和种子田间劣变过程。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.1
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本文编号：2261970