棉铃虫视觉基因的表达模式及功能研究

发布时间：2016-12-26 20:56

  本文关键词：棉铃虫视觉基因的表达模式及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业大学》 2015年

棉铃虫视觉基因的表达模式及功能研究

闫硕  

【摘要】：棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)寄主广泛,繁殖能力和适应能力强,条件适宜时曾大面积暴发成灾,给世界的农业生产带来了巨大的经济损失。灯光诱杀技术的田间应用不仅是棉铃虫预测预报的重要手段,而且是一种高效环保的棉铃虫防控措施。视觉对昆虫搜寻食物和配偶、躲避天敌和不安全环境具有重要的意义。本论文利用分子生物学手段深入研究了棉铃虫视觉基因的功能、趋光行为,一方面从进化上、分子角度上揭示夜行性昆虫对光的高度适应机制,另一方面为从行为上控制棉铃虫提供一定的理论依据,进一步完善棉铃虫综合防治体系。本研究主要包括以下八部分内容： (1)通过显微观察的方式,比较了棉铃虫雌雄蛾复眼的外部形态,观察了复眼内部的结构。结果表明：复眼呈半球形,小眼排列整齐紧密,中心小眼呈正六边形,边缘小眼不规则。雌雄蛾复眼距离、复眼长、复眼宽、复眼周长、单眼距离及小眼数量之间无显著性差异,但各项指标显示雄蛾复眼比雌蛾略大。棉铃虫蛾复眼属于重叠型像眼,小眼结构自外向内分为：屈光器、色素细胞、视杆和基膜四部分。 (2)通过趋光行为测定,比较了棉铃虫不同日龄雌雄蛾对三种波段光源(绿光505nm、蓝光450nm、紫外光源365nm)的趋光反应率。结果表明：趋光反应率与光波段和棉铃虫性别无关,与日龄有关,1-3日龄蛾趋光反应率高于0和6日龄蛾。 (3)利用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(]RACE)从棉铃虫复眼中克隆得到UV、蓝光和长波敏感视觉基因,分别命名为Ha-UV(Gen Bank登录号：HQ641391)、Ha-BL(Gen Bank登录号：JX644013)和Ha-LW (GenBank登录号：JX392054),分别包括1258、1451和1574个碱基,编码379、382和381个氨基酸组成的多肽。 (4)利用在线分析工具对推导得到的视蛋白氨基酸序列进行分析,结果表明：视蛋白Ha-UV(GenBank登录号：ADW20311)分子量(Mw)41.35kDa,等电点(pI)8.05；视蛋白Ha-BL(Gen Bank登录号：AGH28029)分子量43.22kDa,等电点7.02；视蛋白Ha-LW(Gen Bank登录号：AGH28027)分子量41.86kDa,等电点7.97。三种视蛋白均具有七个跨膜拓扑结构,包含G-蛋白偶联受体家族和视蛋白视网膜结合位点的特征序列。同源性分析表明：鳞翅目昆虫的视蛋白氨基酸序列同源性较高。 (5)利用荧光定量PCR技术,探讨棉铃虫复眼中视觉基因表达是否存在昼夜节律。结果表明：在14L：10D光周期下,Ha-UV和Ha-BL的相对表达量在ZT1(进入光期1h)达到高峰,随后下降；Ha-LW的相对表达量在白天下降,夜晚升高。当棉铃虫转移至黑暗下,视觉基因的表达模式没有发生变化,说明视觉基因的表达受到自身的生物节律调控。本试验还证实了棉铃虫两个生物钟基因Ha-CRY1和Ha-CRY2在外周组织(复眼)中执行着生物钟的功能。 (6)荧光定量PCR结果还表明：暗期光照和饥饿处理都能显著影响棉铃虫视觉基因的表达,交配前后棉铃虫视觉基因的表达没有变化。在UV和绿光6小时照射后,Ha-UV的相对表达量上调；视觉基因受到饥饿处理影响表达下调,其中Ha-Uv的相对表达量显著下降。 (7)通过原核表达和人工合成多肽的形式获得抗原,结果表明：原核表达未能获得抗原；通过合成多肽的形式成功制备Ha-UV口Ha-LW的抗体,免疫组化和WestRN Blot技术证实抗体质量良好。Ha-LW视蛋白在ZT1、ZT5、ZT9和ZT21的表达量高于ZT13和ZT17;Ha-UV视蛋白在ZT5和ZT9的表达量高于其它时间点。 (8)通过注射dsRNA的方式干扰视觉基因的表达,结果表明：蛹期注射dsRNA可以显著抑制蛹期视觉基因的表达,但成虫羽化后视觉基因表达急速上调,抑制效果消失；成虫期注射dsRNA至双侧复眼较单侧复眼相比,可以显著抑制视觉基因和视蛋白的表达。注射后24h,Ha-LW和Ha-UV表达受到最大抑制,均为64.3%；注射后24h, Ha-LW和Ha-UV视蛋白的表达受到最大抑制,分别为36.2%和33.7%。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433
【目录】：

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