猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

  本文关键词：宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47对PEDV复制影响，由笔耕文化传播整理发布。

《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集》2015年

猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

华耀  王玮  李郁  孙裴  魏建忠  

【摘要】：引言猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的高度接触性肠道传染病。自2010年10月以来,PED在我国的流行广泛并呈现新的特点,感染PEDV后,哺乳仔猪死亡率达80%~100%,而繁殖母猪和公猪则很少表现出临床症状。建立快速、可靠的PEDV抗体检测方法,进行PED流行病学的监测以及猪群免疫过PED疫苗后抗体水平的检测,对于本病的预防具有重要意义。PEDVS蛋白是病毒主要的结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体,且产生的抗体水平持续时间长,因此S蛋白可作为可靠的检测抗原。本研究以表达的S蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法,为PEDV抗体检测试剂盒的研发和应用奠定基础。材料与方法利用生物学软件对PEDV S蛋白进行抗原位点分析,选择S蛋白的主要抗原表位区,利用RT-PCR扩增S基因,然后重组至表达载体pET-32a(+)中,构建重组pET(+)-32a-S原核表达质粒,进行S蛋白的诱导表达和纯化并采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组S蛋白作为包被抗原,摸索间接ELISA检测方法的抗原包被浓度、一抗的稀释倍数、一抗的作用时间、封闭液的种类、二抗的稀释倍数、二抗的作用时间及显色时间。并通过特异性试验、重复性试验以及与商品化PEDV抗体检测试剂盒和Western-blot对比试验进一步确定所建立间接ELISA检测方法的可行性。结果与讨论成功表达了重组S蛋白,重组的S蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,并成功建立一种基于重组S蛋白的间接ELISA检测方法,优化的反应条件为:蛋白包被浓度为8mg/L,一抗的稀释倍数为1:40,一抗的作用时间是30min,最佳的封闭液时2%BSA,二抗的最佳稀释度为1:1500,的作用时间是45 min,显色时间是10 min。组内及组间变异系数均小于10%,重复性较好。建立的间接ELISA方法与商品化的ELISA抗体检测盒对比试验显示两者符合率为86.67%,敏感性为89.83%,特异性为82.62%;建立的间接ELISA方法Western-blot对比试验显示两者符合率为88.89%,敏感性为90.20%,特异性为83.33%。本研究的建立基于PEDV S蛋白的间接ELISA方法,具有良好的重复性,特异性,敏感性,并可能在临床上成为检测猪群中PEDV抗体水平及监测PED流行情况的有效方法。

【作者单位】：安徽农业大学动物科技学院
【分类号】：S852.65
【正文快照】：

猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立@华耀$安徽农业大学动物科技学院!合肥230036 @王玮$安徽农业大学动物科技学院!合肥230036 @李郁$安徽农业大学动物科技学院!合肥230036 @孙裴$安徽农业大学动物科技学院!合肥230036 @魏建忠$

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