中药复方体外抗TGEV诱导猪小肠黏膜上皮细胞凋亡的机制研究

发布时间：2018-11-28 17:17

【摘要】：猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。该病虽有疫苗预防,但免疫失败时有发生,而西药应用又存在着药物残留等一系列影响人体健康的食品安全问题。开发安全、有效、绿色、环保的新型中兽药成为当务之急。故此,本研究以中药复方为试验材料,以猪小肠黏膜上皮细胞(SIEC)为研究对象,应用流式细胞术、蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR及荧光显微镜等手段和方法,通过对细胞周期、相关细胞信号通路途径、猪氨基肽酶N及抗病毒因子的检测,探讨中药复方干预TGEV诱导SIEC凋亡的作用机制,为临床应用中兽药防控畜禽传染病奠定基础。试验结果显示：1、通过显微镜观察结合MTT法,筛定出中药复方对SIEC的最大安全浓度：复方参术汤为6.25mg/mL,复方连翁汤为1.5625mg/mL,复方参附汤为3.125mg/mL。2、通过MTT法,检测中药复方干预TGEV诱导SIEC与PK-15细胞的活性的影响,结果显示三种中药复方均能体外抑制TGEV对SIEC与PK-15细胞的吸附作用。3、通过流式细胞术,检测中药复方干预TGEV诱导SIEC细胞周期的影响,结果显示中药复方可以改变由TGEV引起的细胞周期在G2/M期发生的阻滞；qRT-PCR检测参与细胞周期调控的蛋白,结果显示中药复方能够显著上调周期蛋白cyclinA与cyclinB1的转录量(P0.05)；荧光显微镜观察经过中药复方处理后感染TGEV的SIEC,结果显示细胞形态比较清晰、完整,呈规则的长梭形,大部分细胞的细胞核结构较清晰,染色质着色较均一,凋亡现象不明显。4、通过Western blot检测,结果显示中药复方可下调TGEV感染SIEC后Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、Cyt c及Bid蛋白表达；qRT-PCR和Western blot检测,结果显示中药复方可以极显著上调Fas和Bcl-2 mRNA的转录(P0.01)及其蛋白的表达,极显著下调Fasl和Bax　mRNA的转录(P0.01)及其蛋白表达；SIEC经Caspase抑制剂处理后与TGEV组相比,可下调Caspase-8、Caspase-9、 Caspase-3蛋白的表达。5、通过qRT-PCR检测,结果显示中药复方可下调TGEV的受体pAPN mRNA表达水平和正向调控GRP78 mRNA表达水平。6、通过qRT-PCR检测,结果显示中药复方TNF-a mRNA转录量高于对照组；中药复方IFN-p mRNA转录量高于TGEV组；中药复方TLR3 mRNA转录量在24h、48h、72h时均极显著低于对照组(P0.01),而高于TGEV组但差异不显著。中药复方NF-kB mRNA转录量在各时间段均显著高于对照组(P0.05)。结论：1、中药复方在适宜浓度范围内(复方参术汤为6.25 mg/mL,复方连翁汤为1.5625mg/mL,复方参附汤为3.125mg/mL),对SIEC既安全又无毒副作用,且能有效抑制TGEV对SIEC的吸附,明显改善由TGEV感染SIEC产生的CPE现象,从而起到保护细胞的作用。2、中药复方能够正向调控SIEC关键的凋亡因子(Fas/Fas1、Bcl-2/Bax、Cyt-c、Bid)、周期蛋白(cycliA、cyclinB1)及TGEV受体(pAPN)基因或蛋白的表达水平,从而抑制Caspase的活性、改善细胞周期活动、阻断TGEV的吸附和在细胞内的复制,达到抑制TGEV诱导SIEC凋亡的目的。3、中药复方可以通过提高相关抗病毒因子(IFN-β、TNF-α、 TLR3、NF-kB)的转录量,抑制病毒基因组复制或干扰其蛋白合成等方式发挥抑制TGEV增殖的作用。整体研究最终表明,中药复方具有预防TGEV感染SIEC的作用。
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【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28

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本文编号：2363663