菊花花青素苷依光合成的分子机制

发布时间：2018-11-29 10:55

【摘要】：花青素苷是使花朵呈色的重要色素之一,其合成与积累过程与植物发育和外部环境条件密切相关,但是目前环境因子对花青素苷生物合成调控的分子机制尚未得到清楚的解析。光是影响花青素苷生物合成最重要的环境因子之一,通过适当调控观赏植物生长的光照条件可以显著提高其观赏价值和经济价值。因此,解析光照调控花青素苷生物合成的分子机制具有理论价值和实际意义。菊花(Chrysanthemum xmorifolium Ramat.)是世界著名花卉,花色表型变异十分丰富,其简单的色素代谢背景和呈色过程中对光照的高度敏感性使其成为研究花青素苷依光合成分子机制的理想材料。目前对菊花花青素苷依光合成的研究多集中在表型和生物化学分析层面,从分子水平上解析光照如何诱导花青素苷生物合成途径上关键结构基因的表达则较少报道,并且调控结构基因表达的关键调节基因也尚未被鉴定和分离,限制了通过调节光照条件对菊花花色进行改良的分子育种研究。本研究以对光照条件高度敏感的紫色系菊花品种‘丽金’为研究材料,对遮光导致褪色的样品中的色素成分及含量进行对比分析,并通过一系列生物信息学和基因表达分析解析了菊花花青素苷依光合成的分子机制。本研究获得的主要结果如下。1.对‘丽金’的头状花序和叶片分别进行遮光处理,以正常光照处理和全株遮光分别作为阳性和阴性对照。花色表型变化的分析结果表明,3组遮光处理下舌状花均明显褪色,且花序遮光处理下的褪色比叶片遮光处理更显著；色素分析结果表明,其舌状花中含有2种矢车菊素衍生物和5种黄酮衍生物,并且3种遮光处理下舌状花中花青素苷的相对含量随花序发育呈现“先上升后下降”的趋势,下降的显著程度与花色表型的分析结果一致。上述结果说明随花序发育,光照显著影响‘丽金’舌状花中2种矢车菊素苷组分和含量的变化；其头状花序和叶片均能响应光照并影响花青素苷的生物合成,但花序比叶片的感光能力更强：花序发育早期是花青素苷生物合成过程中响应光照的关键时期。2.对‘丽金’花序发育的前3个阶段进行遮光处理,并以正常光照处理作为对照组,构建了5个转录组文库；通过RNA序列的从头组装获得了103,517个特异unigene,其中60,712(58.65%)个unigene在4个蛋白数据库中获得了注释；之后通过生物信息学分析筛选出了2,135个响应光照的unigene;代谢通路分析结果表明,花青素苷代谢通路是唯一的既响应光照又与花发育相关的完整通路；在遮光条件下,几乎所有花青素苷生物合成途径上的结构基因的表达都被抑制,与舌状花褪色和花青素苷积累量的下降相吻合；通过构建系统发育树,筛选出了4个参与调控菊花花青素苷依光合成的关键转录因子。依据这些结果,推测花青素苷生物合成途径上的13个结构基因家族成员和4个转录因子随花序发育的依光表达可能导致了‘丽金’舌状花中花青素苷组分和含量发生变化。3.使用数字基因表达谱技术从转录组文库中筛选出了9个表达差异不显著的候选内参基因,之后使用geNorm、NormFinder和qBase plus对候选基因在不同光照处理下3个色系的‘丽金’品种中随花序发育的表达稳定性进行了综合分析,并用CmF3H基因对内参基因表达的稳定性进行了验证,发现CmF-box和CmPP2A是适用于不同光照处理下基因表达验证分析的最稳定的内参基因。这些结果为验证17个候选基因的依光表达模式提供了最合适的内参基因。4.使用上述在不同光照条件下稳定表达的内参基因,通过对比参与调控菊花花青素苷依光合成的候选结构基因和调节基因以及光信号转导途径的上游基因在舌状花和叶片中的表达模式,发现转录组分析筛选出的CmCHS1、CmCHS2、CmF3H、 CmF3'H1、CmF3'H2、 CmF3'H3、CmDFR、CmANS1、CmANS2、CmANS3、Cm3GT、 Cm3MT1、Cm3MT2、CmMYB5-1、CmMYB6、CmMYB7-1和CmbHLH24等17个基因家族成员的确是参与调控菊花花青素苷依光合成的关键基因,并且CmHY5的表达量与花青素苷的含量呈正相关关系,而CmPHYA、CmPHYB、CmCRY1a、 CmCRY1b和CmCRY2等5个光受体基因的表达与花青素苷的依光合成相关性较弱；CmCOP1基因的表达与花青素苷的含量也没有明显的相关性；此外,大多数花青素苷生物合成途径上的结构基因和调节基因在舌状花中特异性表达。5.在转录组分析和基因表达验证的基础上,利用iTRAQ技术从‘丽金’舌状花中鉴定得到5,106个原始蛋白,并从中筛选出了45个遮光后上调表达和115个下调表达的差异蛋白,发现大多数花青素苷生物合成酶在遮光后下调表达,与编码基因表达量的变化和花色表型的分析结果一致；遮光后,光捕获叶绿体蛋白的表达丰度随花序发育逐渐上升；通过功能和通路富集分析,推测GDSL脂酶可能在菊花花青素苷依光合成的过程中发挥作用。这些结果说明花青素苷生物合成途径上7个关键酶的依光表达是导致‘丽金’舌状花呈色的直接原因。6.扩增得到了4个关键调节基因的cDNA全长序列,分析发现只有CmMYB6的氨基酸序列中含有双子叶植物中促进花青素苷生物合成的R39、V64、A90和ANDV保守氨基酸位点；启动子序列分析结果表明,CmMYB6的启动子序列中含有3个光响应元件和2个bHLH转录因子的结合位点；与对照相比,CmMYB6转基因烟草株系的花色明显加深,花朵中花青素苷的相对含量显著增加,并且CmMYB6, NtDFR和NtANS基因的相对表达量也显著上升,说明CmMYB6的确是促进菊花花青素苷依光合成和积累的关键调节基因。综合上述研究结果,作者初步推测出了菊花花青素苷依光合成的分子机制：头状花序感知光信号后,通过光信号转导途径逐步激活菊花花青素苷生物合成途径上编码7个关键酶(CmCHS、CmF3H、CmF3'H、CmDFR、CmANS、Cm3GT和Cm3MT)的13个结构基因家族成员(CmCHS1、CmCHS2、CmF3H、CmF3'H1、CmF3'H2、 CmF3'H3、CmDFR、CmANS1、CmANS2、CmANS3、Cm3GT、Cm3MT1和Cm3MT2)的表达,从而促进查尔酮、柚皮素、二氢山奈酚、二氢槲皮素、无色矢车菊素苷元、矢车菊素苷元和矢车菊素-3-葡萄糖苷等7个中间产物以及矢车菊素-3-O-(6"-O-丙二酰基-葡萄糖苷)和矢车菊素-3-O-(3",6"-O-二丙二酰基-葡萄糖苷)等2个矢车菊素衍生物(终产物)的合成与积累,最终促使舌状花呈色。在13个结构基因家族成员的依光表达过程中,正调节基因CmMYB5-1、CmMYB6和CmbHLH24以及负调节基因CmMYB7-1响应光照并协同调控结构基因的表达。本研究为深入理解观赏植物花青素苷依光合成的分子机制奠定了理论基础,并为通过调节光照条件进行菊花花色改良的分子育种研究提供了参考。
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【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.11
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本文编号：2364803