白菜组蛋白赖氨酸甲基化相关SDG家族的演化与在花粉发育中的作用分析

发布时间：2018-12-14 10:53

【摘要】：花粉发育是植物有性生殖的关键环节,涉及有丝分裂、减数分裂等截然不同的细胞学过程以及绒毡层降解、花粉壁形成等独一无二的生物学过程,同时也与农业生产上的雄性不育、作物产量、种子品质等问题密切相关,对该过程的研究兼具理论与实践意义。组蛋白赖氨酸甲基化共价修饰通过对花粉发育相关基因的选择性转录参与这一过程。在植物中,SET domain group (SDG)家族是唯一具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性的蛋白家族,其在多个物种中的成员组成业已明确,对亚家族的分类方式也己达成共识。但是目前对SDG家族的演化过程缺乏系统性研究,对四个主要亚家族之间的相对演化关系也并不明确。此外,数个SDG基因已被证实在拟南芥中表达的异常会引起花粉败育,而对拟南芥不同发育时期花粉芯片表达数据的梳理表明应有更多的SDG基因参与了这一过程。本研究基于已公布的基因组数据,对白菜SDG家族的成员进行筛选查找、序列分析,并通过与拟南芥直系同源基因的比较,探讨了白菜SDG家族的演化过程以及四个主要亚家族基因的演化模式及起源。随后,对H3K4me3和H3K27me3两种与基因表达密切相关的共价修饰在白菜花粉发育中的变化进行了跟踪检测,并从白菜花蕾转录组数据中筛选得到了一系列可能与花粉发育相关的候选SDG基因。最后,分析了一个在白菜雄性不育株系花序中特异高表达的SDG基因(ASHR1)的表达模式,并分别以白菜和拟南芥为材料对该基因的功能进行了鉴定。主要研究结果如下：(1)通过对白菜基因组数据库的分析,筛选得到白菜SDG基因67个,并根据它们与拟南芥基因的共线性关系,找到2个额外的拟南芥SDG基因。白菜SDG基因分布在10条染色体上,与拟南芥直系同源基因具有良好的共线性关系：它们分属于7个亚家族,各亚家族之间在基因长度、基因结构和编码蛋白的结构域上具有明显差异；相比于其他物种,白菜SDG基因数目多,占基因组比例大；大量旁系同源基因对在表达模式和亚细胞定位上具有显著差异。(2)通过与拟南芥直系同源基因的比较,发现白菜SDG家族中E(z)、Ash、Trx和Suv四个主要亚家族的成员与拟南芥直系同源基因具有较大差异。其中逾半数基因的基因结构与拟南芥直系同源基因存在差异,这些差异涉及内含子的增加、丢失,外显子的增加、丢失以及内含子相位的移动。结合其他物种直系同源基因的序列分析,表明这些差异基本产生自白菜。蛋白结构域架构分析同样表明大量白菜SDG蛋白有别于拟南芥直系同源蛋白,且部分结构域或结构域的架构方式在所研究的其他物种中都不存在,而仅存在于白菜。农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达和基因枪介导的洋葱表皮细胞瞬时表达实验证实白菜和拟南芥中4对直系同源SDG蛋白具有不同的亚细胞定位。利用Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood (PAML)软件进行的分子演化速率分析表明近1/3的白菜SDG基因具有较快的分子演化速率。(3)通过对SET结构域内含子相位的分析,明确了SDG家族四个主要亚家族的演化模式。E(z)亚家族起源于1个祖先基因,Ash亚家族起源于3个祖先基因,Trx亚家族起源于2个祖先基因,Suv亚家族起源于3个祖先基因。对四个主要亚家族基因在基因结构、结构域架构、亚细胞定位和分子演化速率上差别的综合分析表明,各亚家族之间在演化速率上具有明显差异。其中Trx亚家族演化速率最快,SUVR亚族次之,E(z)亚家族再次之,而SUVH亚族和Ash亚家族演化速率最慢。(4)利用免疫荧光分析确定了H3K4me3和H3K27me3两种共价修饰在白菜花粉发育中的变化模式。H3K4me3存在于花粉母细胞、单核小孢子的细胞核以及双核花粉的营养核和三核花粉的营养核和精细胞。H3K27me3除同样存在于上述时期花粉的细胞核外,还存在于双核花粉的精核中。两种共价修饰都不存在于四分体时期的花粉。(5)对白菜从花粉母细胞时期到成熟花粉期5个不同发育级别花蕾转录组测序数据的分析发现,44个白菜SDG基因在花蕾各发育阶段表达,除一个基因外,其余基因根据其表达模式可以分为5个类群,分别对应于花粉发育的5个时期。其中70%的基因在花蕾发育的不同阶段差异表达,41%的基因在可育株系和不育株系各级花蕾中差异表达。通过与拟南芥芯片数据的综合比较,筛选得到7个极有可能作用于花粉发育的候选SDG基因,包括2个已证实作用于该过程的基因。(6)利用定量PCR技术研究表明,实验室早期利用拟南芥芯片筛选得到的在不育株系中高表达的SDG基因ASHR1在除代表四分体时期花蕾以外的花蕾中表达量均高于可育株系。原位杂交分析表明该基因在单核小孢子和双核花粉中表达。(7)通过全长扩增发现白菜ASHR1基因座上至少可以生成5种可变剪接转录本,其中原始转录本(BrASHR1.1)表达水平显著高于其他转录本。拟南芥ASHR1基因座上存在2种可变剪接转录本,原始转录本(AtASHR1.1)的表达水平与可变剪接转录本(AtASHR1.2)的表达水平相当。此外,通过在拟南芥中过表达AtASHR1.2,发现异位表达的AtASHR1.2会被剪接形成AtASHR1.1.(8)ASHR1在白菜和拟南芥中的过表达没有对花粉和种子等的发育产生影响,但是ASHR1在拟南芥中的过表达会造成材料抽薹时间的推迟。在拟南芥ASHR1表达缺失突变体中同样没有观察到花粉发育的异常,但是抽薹时间提前。定量PCR分析显示,在拟南芥ASHR1表达缺失突变体中成花抑制基因FLC的表达收到了抑制,表明ASHR1通过影响FLC的表达,调节了植物的抽薹时间。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S634
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本文编号：2378491