传染性造血器官坏死病毒中国株遗传进化分析及检测方法研究和应用

发布时间：2018-12-28 09:44

【摘要】：2014年,中国已有25个省(直辖市、自治区)发展鲑鳟养殖业,全年总产量达39,164吨。然而,不断出现的疾病对中国迅速成长的鲑鳟养殖业造成极大危害,特别是传染性造血器官坏死病(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)。IHN是一种主要感染鲑鳟的病毒性传染病,感染后死亡率达90%以上,其病原为隶属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)粒弹状病毒属(Novirhabdovirus)的传染性造血器官坏死病毒(Infectious heamotopoietic necrosis virus,IHNV)。自1985年中国黑龙江省首次报道IHN以来,该病已传播至中国北京、河北、辽宁、山东、甘肃、四川、吉林、新疆等省(直辖市、自治区)。据2014年中国水生动物卫生状况报告显示,北京、河北、辽宁、山东和甘肃5省(直辖市)冷水鱼养殖场点IHN平均阳性率为36.7%,且局部发生IHN疫情。其中,河北IHN平均阳性率更是高达84.6%。更值得注意的是,部分地区的鲑鳟原良种场和重点苗种场被检出IHN,成为中国鲑鳟养殖业发展的重大安全隐患。因此,明确IHNV在中国分布和遗传进化特征,为其风险分析和防治具有重要意义。另外,中国每年从国外引进大量鲑鳟发眼卵,而国外不断发生的IHN疫情,需要我们不断提高检疫技术水平,以防致病力强和新基因型IHNV毒株传入。本研究旨在明确IHNV在中国的分布、遗传进化、传播路径和变异情况,解析IHNV中国株全基因组特征及基因突变情况,并建立相应的检测方法,以期用于IHNV的检疫和防控。本研究从中国黑龙江、吉林、辽宁、河北、四川、云南、甘肃7省采集鲑鳟样品428份,50个样品IHNV检测结果为阳性,平均阳性率为11.68%。基于IHNV mid G序列的遗传进化分析表明,49株(49/50)IHNV属于J基因型J Nagano基因亚型,1株(1/50)属于M基因型MN基因亚型。另外,Bj LL中国株属于M基因型MA基因亚型,而非之前报道的U基因型。这是首次在中国监测到M基因型MN基因亚型IHNV。针对新基因型的传入,本研究对输华鲑鳟的检疫工作提出相应风险管理措施建议。遗传进化分析推断MN基因亚型IHNV株于1994年前由美国传入中国,并在中国辽宁地区流行,而MA基因亚型IHNV株于2003年由美国传入中国,并在北京地区流行。50株IHNV可分为11个序列类型,即m G801J~m G8010J和m G811M。其中,39株IHNV(39/50)属于m G801J序列类型,1株属于m G802J序列类型,2株属于m G803J序列类型,2株属于m G804J序列类型,m G805J~m G810J和m G811M序列类型各1株。综合分析IHNV中国株序列类型、遗传进化和流行病学信息,推测m G801J序列类型(39株IHNV)IHNV毒株可能由同一毒株进化而来,且由黑龙江通过发眼卵传播至甘肃、辽宁、吉林和河北地区。2株IHNV云南株属于m G804J序列类型,推断云南地区IHNV的传染源来自黑龙江。甘肃地区监测到m G801J和m G805J 2种序列类型,并推断传染源来源于黑龙江和河北地区。四川IHNV株属于m G810J序列类型,推测IHNV传入四川后,在当地养殖场交叉传播,且与当地环境相互作用下,可能其毒力发生变化。本研究报道IHNV感染七彩鲑(Salvelinus fontinalis)并导致其出现低水平死亡率,为IHNV易感动物研究提供参考。从发病的七彩鲑中分离到一株IHNV,将其命名为Ch20101008株,并成功克隆其全基因组。该毒株基因组大小为11,129bp,含有N、P、M、G、NV和L 6结构基因,整个基因组有198个碱基位点发生基因突变,其中53个碱基突变导致氨基酸改变,在L基因5’UTR 4959位点缺失1个碱基A。相对于U基因型IHNV毒株,中国株全长G基因共15个碱基位点出现突变,且7个导致氨基酸突变,为IHNV中国株疫苗研制和致病机理研究提供参考。为实现快速、准确、定量检测IHNV,本研究建立了微滴式数字RT-PCR方法(Reverse transcriptase digital droplet PCR,RT-dd PCR)、RT-LAMP荧光方法(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)和特异性的单克隆抗体,并对其进行初步验证和应用。与实时荧光RT-q PCR相比,RT-dd PCR方法表现出与之相近的特异性、灵敏性和重复性,最低检测限为0.6copies/μL,且RT-dd PCR方法实现了对IHNV的绝对定量检测。实际应用过程中,RT-dd PCR方法的检出率高于RT-q PCR方法。所建立的RT-LAMP荧光检测方法具有较好的灵敏性和特异性,且较大幅度缩短了检测时间,避免了由于开盖加染料而导致的假阳性问题。RT-LAMP荧光检测方法的检测限为3.64×10-7μg/μL,比常规RT-PCR高1,000倍,和实时荧光RT-q PCR相同。将RT-LAMP荧光检测方法进行初步应该,结果表明该方法与RT-q PCR方法、RT-PCR的诊断特异性相同,但诊断灵敏性低于RT-q PCR方法。本研究以IHNV全长G基因的表达产物为抗原,通过常规技术筛选出2株抗IHNV的单克隆抗体(5H3和6G7),其效价分别为1:18,000和1:20,000,两株抗体均具有良好的特异性,并成功申请国家发明专利。应用制备的抗体,初步尝试建立了检测IHNV的荧光纳米微球检测卡,并进行了初步应用。与RT-PCR方法相比,该检测卡的阳性检出率为41.67%,说明其灵敏性低于RT-PCR方法,有待进一步优化改进。以本研究获得的成果和世界动物卫生组织(OIE)《水生动物疾病诊断手册》规定的检测技术为基础,我们修订了出入境检验检疫行业标准《传染性造血器官坏死病检疫技术规范》(标准号:SN/T1474-2014)。另外,将建立的RT-LAMP方法转化成农业部水产行业标准《染性造血器官坏死病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法》(已提交送审稿)。将本研究建立的三种分子生物学方法(RT-dd PCR方法、RT-LAMP荧光方法和荧光纳米微球检测卡)与《传染性造血器官坏死病检疫技术规范》规定的病毒分离、RT-PCR方法、RT-q PCR方法(文献报道)进行比较应用。结果表明,检出率由高到低依次为RT-dd PCR方法(44%)、RT-q PCR方法(43%)、RT-LAMP方法(42%)、病毒分离(23%)和荧光纳米微球检测卡(15%),样品新鲜度和采样形式等因素对每种方法的检出率影响明显。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941

【参考文献】