原儿茶酸影响动物肠道屏障功能的研究

发布时间：2018-12-28 17:06

【摘要】：原儿茶酸(PCA,3,4-二羟基苯甲酸)广泛分布于许多植物及中国传统药材中,如冬青,乌蕨等等。PCA的抗氧化、抗菌、抗病毒和抗炎功能及其在抗癌、抗溃疡、抗糖尿病、抗老化和抗纤维中的应用已得到广泛研究。本研究在体外探究了 PCA对四株不同细菌的抑制及杀菌作用基础上,研究了 PCA对小鼠肠道屏障功能的调节作用,及其抗鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurSum 感染的机制。此外,体外实验研究了 PCA对小鼠RAW264.7巨噬细胞免疫功能的影响及机理。最后,探究了 PCA对黄羽肉鸡的生长性能、肉质和肠道屏障的影响。主要研究内容和结果如下:1.PCA对主要病原菌的抑菌效果体外抑菌实验表明,PCA对鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)、大肠杆菌(E.coli)及金黄色葡萄球菌(S.aureus)均有抑制作用,并且高浓度的PCA(超过2mg/mL)对细菌生长有长时间抑制作用,且对这四株菌有很强的杀菌能力。从毒素基因表达看,PCA显著下调了 S.typhimurium菌InvA、SopD、SipB、HilA和SsrB的表达,表明PCA可通过体外调节毒力因子的表达来抑制细菌生长,并且PCA抑菌和杀菌的机制不同于庆大霉素(Gentamicin,GM)。以上结果表明,PCA可有效抑制和杀灭鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌,并且可通过体外调节毒力因子的表达来抑制沙门氏菌。2.PCA对小鼠肠道屏障功能的调节作用及抗沙门氏菌感染的能力分别对小鼠饮水给药PCA(50mg/kg/天)、GM(80mg/kg/天),并设置对照组,饲喂周期为28天。结果表明,与对照组相比,小鼠口服PCA可明显增加体重;对肝脏、脾脏、结肠、回肠的结构无不良影响;显著增加了肝脏指数和脾脏指数;使小鼠回肠与结肠中NO和sIgA含量略有增加;显著提高结肠屏障相关蛋白的基因表达。菌群分析表明,PCA并未影响菌群的β多样性,但可显著提高厚壁菌门(Fimicuttes)的相对丰度,降低拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度;PCA处理后,厚壁菌门(门水平)、乳杆菌(目到属水平)、脱硫弧菌(纲到属水平)等为优势菌。以上结果表明,50mg/kg/天PCA对小鼠安全性良好,并且可以改善小鼠肠道菌群,增强肠粘膜屏障及机体免疫功能。上述饮水给药28天后的实验小鼠,分别灌胃S.typhimurium(4×108CFU/只)进行攻毒。结果表明,与沙门氏菌感染小鼠相比,PCA预处理可以显著降低小鼠的死亡及体重损失;显著降低沙门氏菌在回肠、结肠、盲肠的定植,显著改善结肠和回肠病变及肠绒毛脱落、断裂等情况;显著上调结肠中屏障蛋白的基因表达;显著降低血清、结肠内炎性细胞因子如IFN-γ,IL-12,TNF-α的增加;并可降低肝脏、MLN内炎性细胞因子的表达;显著改善血清及肠道中抗体IgG、sIgA的急剧增加;显著并且降低其向肝脏、脾脏的转移;降低脾脏和肝脏肿大,下调肝脏caspase-1活性,抑制肝细胞凋亡。同时,PCA可以显著提高沙门氏菌感染小鼠肠道中厚壁菌翘(Fimicutes)的相对丰度,降低拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度;厚壁菌门(门水平),脱硫弧菌(纲到属水平)等为优势菌。可降低沙门氏菌毒力基因InvA、SopD、SipB、SsrB和Hi1A在盲肠内容物中的丰度。综上,PCA可以通过改善感染小鼠肠道免疫功能、紧密连接和肠道菌群组成来抑制沙门氏菌在肠道中的定植及其向各组织器官的转移,从而抑制沙门氏菌感染造成的多器官损伤及全身性炎症反应。3.PCA对小鼠RAW264.7巨噬细胞免疫功能的影响分别采用1～500μg/mL PCA处理RAW264.7细胞系,CCK-8和胞外LDH测定发现100 μg/mL及以下浓度PCA对RAW264.7细胞为安全浓度;5～100 μg/mL的PCA均可提高RAW264.7的ACP活性,其中25μg/mL PCA处理时,ACP活性提高最多,后续使用该浓度进行探究。PCA可有效提高RAW264.7胞内LDH的活性;上调RAW264.7标志分子CD80、CD86、MHCII的表达,表明PCA可激活小鼠RAW264.7细胞;PCA可提高RAW264.7的tNOS活性和NO含量;上调促炎及抑炎因子的基因表达,下调M2极化相关基因MR、Fizz1的基因表达;增加IL-1、IL-6、IL-12和TGF-β的分泌。PCA处理可以显著提高RAW264.7细胞吞噬葡聚糖、沙门氏菌和大肠杆菌的能力及杀灭大肠杆菌的能力。以上结果表明,PCA能够调节RAW264.7的免疫功能,促进M1极化、抑制M2型极化来提高其抵抗病原菌感染的能力;4.PCA对黄羽肉鸡的生长性能、肉质及肠道屏障功能的影响分别对黄羽肉鸡饲喂300mg/kg/天和600mg/kg/天PCA,实验为期52天,同时设置空白对照及抗生素对照组(恩拉霉素,200mg/kg/天)实验表明,300mg/kg/天的PCA可显著提高肉鸡末重,并且降低料重比;提高肉鸡活重及胴体重;并提高肉鸡胸肌L值(亮度)和a值(红度),降低b值(黄度),改善肉质;可显著减少血浆中AKP和DAO活性;提高肠道中总超氧化力、GST-ST及GSH-Px的活性;减少肝脏中MDA含量,并提高肝脏总抗氧化力;显著增加血浆和空肠肠粘膜中IL-10、TGF-β的含量,并降低IL-2和IFN-γ;降低肝脏中凋亡相关基因的相对表达,提高肠道屏障基因的表达。同时,菌群分析表明PCA增加盲肠菌群的a多样性,并显著提高厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度,降低拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobbacteria)的相对丰度。以上结果表明,PCA可通过改善肉鸡抗氧化能力、肠道免疫功能和紧密连接及肠道菌群结构来提高肠道屏障功能,并改善肉鸡生长性能和肉质。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S853.7
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本文编号：2394211