溶藻弧菌中σ~E和群体感应系统介导的毒力调控机制

发布时间：2018-12-29 13:11

【摘要】：群体感应系统是一种广泛存在于不同种属细菌中,对细菌的各种生理机制起重要调控作用的信号转导机制。这种机制使细菌能像多细胞生物一样进行细菌细胞间的交流、通讯和信号转导。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种海水养殖业中重要的病原菌,也是一种重要的食源性病原菌。溶藻弧菌毒力因子的表达受环境因子(如温度和菌群密度)的严格调控,但是人们对其分子机制仍知之甚少。可替换σ因子RpoE在细菌中广泛参与调控毒力相关基因的表达并响应温度、盐度和渗透压等环境应激。本课题中,我们考察了RpoE对LuxR表达的调控作用。缺失突变株ArpoE在不同应激条件下存活能力明显弱于野生株,在斑马鱼中的定殖能力也显著减弱。在溶藻弧菌中,胞外碱性丝氨酸蛋白酶Asp的表达受温度调控,在37℃下表达量最高,而缺失株ArpoE在任何温度下都不表达Asp,表明RpoE参与温度影响毒力相关基因的调控过程。RpoE参与温度依赖性毒力调控作用,依赖于群体感应中枢调节子LuxR。EMSA、DNase Ⅰ footprinting和体外转录实验结果表明,RpoE直接结合到luxR启动子的-10区和-35区,激活该基因的转录。ChIP和EMSA实验结果表明,在30～37℃时,RpoE直接结合到luxR、rpoH和rpoE的启动子上,当温度继续升高至42℃时,RpoE对luxR启动子的亲和力减弱,但是对rpoH和rpoE的启动子仍然具有很高的亲和力。因此,RpoE以一种温度依赖的方式,通过对不同启动子亲和力的差异,实现RpoE在调控毒力基因的表达和响应温度应激之间的转换。温度介导RpoE释放至胞质中,启动毒力表达和/或应激响应依赖于蛋白酶DegS对反sigma因子RseA的切割作用。溶藻弧菌可以感知温度的变化,实现毒力表达和响应温度应激,并进行两种生理状态的转换。群体感应系统不但感知高细胞密度,实现对毒力的调控作用,而且还能感知低细胞密度的生理状态,对某些基因的表达实现调控作用。这两种不同的调控模式中,在高密度下主要依赖于LuxR蛋白进行调控,在低密度下主要通过AphA蛋白进行调控。通过RNA-seq方法鉴定出溶藻弧菌中有511个基因的表达受到了LuxR蛋白的调控,ChIP-seq方法在全基因组上鉴定出有128个基因被LuxR蛋白直接调控。用EMSA和qRT-PCR方法验证了上述组学实验结果,确定了LuxR结合在启动子序列上的结合模序。LuxR蛋白直接结合到T6SS2的启动上,调控T6SS的杀菌作用,LuxR蛋白还通过直接结合到aphA的启动子上,抑制该基因的表达。这些结果表明,LuxR蛋白是群体感应高密度下重要的调控因子,直接或间接调控很多基因的表达。本实验还考察了AphA蛋白的主要功能及其在低密度时参与的基因表达调控作用。AphA主要通过影响胞外蛋白酶、运动性、生物被膜以及在宿主体内定殖来实现对溶藻弧菌毒力的调控。AphA对碱性丝氨酸蛋白酶Asp的调控主要通过LuxR蛋白来实现。通过ChIP-seq方法,鉴定出溶藻弧菌全基因组上有48个基因在低密度下被AphA蛋白直接调控,确定了AphA结合在启动子序列上的结合模序。除了调控LuxR、sRNA、代谢和运动性相关基因的表达,AphA蛋白还直接结合到自身的启动子上抑制其自身的表达。这些结果表明,AphA蛋白是低密度下重要的群体感应调控因子。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941.4

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本文编号：2394870