补体C3及其缺失突变体与CLIC1蛋白相互作用的初步研究

发布时间：2017-02-13 17:19

  本文关键词：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac130（gp16）和ac132的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

《安徽医科大学》 2015年

补体C3及其缺失突变体与CLIC1蛋白相互作用的初步研究

王二宁  

【摘要】：目的本实验为研究C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白与CLIC1蛋白的相互作用,分别构建带FLAG标签的C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)的真核表达载体,将C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)质粒通过转染的方法转染至COS7细胞,观察各组分蛋白在细胞中的定位;构建缺失突变体酵母表达载体,进行酵母双杂交实验;通过将C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)质粒与CLIC1蛋白共同瞬时转染至HEK293T细胞,通过免疫共沉淀技术,在哺乳动物细胞内,检测C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白与CLIC1蛋白的相互作用。方法根据PCR方法分别扩增野生型C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)序列,酶切回收目的片段,插入到p CDNA3.1载体上,构建p CDNA3.1-C3-FLAG、p CDNA3.1-C3(1-840)-FLAG、p CDNA3.1-C3(824-1663)-FLAG质粒;用同样的方法构建p GADT7-C3(1-840)、p GADT7-C3(824-1663)、p GBKT7-C3(1-840)和p GBKT7-C3(824-1663)酵母表达载体,对于酶切鉴定正确的质粒,跟Marker对比后正确的送往测序公司测序。分别将C3的缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)和CLIC1的酵母表达载体,共同转化至酵母菌AH109中,在SD/-Leu/-Trp/-His/3AT/X-α-gal固体培养基上进行筛选,利用酵母双杂交技术,检测C3的缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)和CLIC1蛋白在酵母细胞中大致的蛋白质相互作用。把已构建成功的p CDNA3.1-C3-FLAG、p CDNA3.1-C3(1-840)-FLAG、p CDNA3.1-C3(824-1663)-FLAG质粒分别转染到COS7细胞中,细胞制片后在荧光显微镜下观察;分别将带FLAG标签的C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)与带GFP标签的CLIC1质粒共转到HEK 293T细胞,通过免疫共沉技术,检测C3及其缺失突变体蛋白与CLIC1蛋白在HEK 293T细胞中的相互作用。结果根据测序公司的测序结果比对基因序列确定构建是否成功。酵母实验中,共表达C3及其缺失突变体C3(1-840)与CLIC1两种融合蛋白后细胞没有变蓝,而共表达C3(824-1663)与CLIC1两种融合蛋白后,在酵母盘子中有细胞变蓝,说明有相互作用;在免疫荧光显微镜下观察,在COS7细胞中,C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白主要分布在细胞质中,在细胞核中几乎没有,CLIC1蛋白的分布主要在细胞核内,尤其是在核膜上,细胞质中较少分布;而C3(824-1663)的缺失突变体蛋白的定位除在细胞质中分布外,在核膜处有斑点集中分布。共定位实验观察到缺失突变体C3(824-1663)与CLIC1蛋白在细胞质中有共定位现象,而C3和缺失突变体C3(1-840)与CLIC1蛋白在细胞质中不存在明显的共定位。根据免疫共沉淀的结果显示,在HEK 293T细胞中,C3和C3(1-840)与CLIC1蛋白不存在相互作用。结论通过以上实验证明了C3和C3(1-840)蛋白与CLIC1蛋白在细胞中没有相互作用,C3(824-1663)与CLIC1蛋白在细胞内可能存在相互作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

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本文编号：242557