马甲状腺上皮细胞抗FMDV感染机制研究

发布时间：2019-03-06 07:30

【摘要】：虽然FMD是一种低死亡率的疾病,但是庞大的受影响动物数字使得它对全球的影响不容忽略。这种疾病对经济的冲击不仅是由于它的发生引起的生产减少以及畜群结构变化造成的直接造失,还有由于口蹄疫的控制,改进生产技术甚至难以进入市场造成的间接损失。据估计,在流行地区,FMD引起的可见生产损失和疫苗接种耗费大约65-210亿美元／每年。而在FMD非流行的国家和地区,爆发FMD造成的损失大于15亿美元／每年。因此,了解FMDV的感染过程和感染机制并进一步进行有效控制就尤为重要。做为对FMDV不易感的一种特殊存在动物,马不感染FMDV的机制却仍然不清楚。在本研究中,本研究借助基因表达谱技术,阐明马抵御FMDV感染的机理。主要研究内容和结果如下：1整合素受体的差异不是马抵抗FMDV的关键因素。本研究比较了被病毒攻击后,牛和马甲状腺上皮细胞(分别为BTYECs和ETYECs)中αv和β亚基的改变。结果表明,BTYECs和ETYECs对整合素受体的利用率几乎一样。将牛和马的αv、β亚基分别克隆后转入SW480和COS-1细胞。FMDV利用异源整合的huαv/eβ3和huαv/eβ6的效率高于huαv/bβ3和huαv/bβ6。在不表达αv和β亚基的COS-1细胞中,无论是同源性结合,如eαv/eβ3, eαv/eβ6, bαv/bβ3和bαv/bβ6,还是异源性结合,如eαv/bβ3,eαv/bβ6, bαv/eβ3和bαv/eβ6,这些受体都能成功介导FMDV的复制过程。并且相比较而言,eαv/eβ3, eαv/eβ6的效率高于bαv/eβ3和bαv/eβ6。整合素受体的差异不是马抵抗FMDV的关键因素。FMDV能在BTYECs高效复制但是不能在ETYECs上复制；FMDV在马TYECs中激发的凋亡程度远高于牛TYECs。2基因表达谱分析确定了BTYECs和ETYECs在被攻毒之后基因表达的差异。收集以O/CHA/1999, A/CHA/2009, and Asia 1/JS/2005三种亚型FMDV感染后2,4,8,12,24,36,48小时的BTYECs和ETYECs,并以未攻毒细胞做为对照组制作基因表达谱。K-MEAN聚类、GO和KEGG分析显示,BTYECs和ETYECs的差异基因主要共有66个。虽然很多基因都能通时在BTYECs和ETYECs中被激活,但ETYECs中,大多数基因在攻毒后早期阶段(2小时起)就开始升高。而BTYECs的基因,其表达水平的变化则不是很不一致,基本都是在4小时或12小时以后。这66个基因主要集中于PI3K-Akt和TLR信号通路上。随后本研究又对PI3K-Akt口TLR通路上的基因进行了验证,结果表明,BTYECs和ETYECs都能激活TLR9-Myd88-IRF7-IFNα1/β1和TLR3-IRF7-IFNα1/β1通路,但是BTYECs的激活滞后很多。FMDV在ETYECs细胞中激活PI3K-Akt-Bim促凋亡通路,而在BTYECs中PI3K-Akt-Bcl2抗凋亡通路。3依据ETYECs的基因表达模式在BTYECs上进行通路验证。1)TLR通路,分别对TLR3、MyD88和IRF7做干扰和过表达并攻毒。除过MyD88干扰的细胞外,其它几种处理抑制了病毒在BTYECs细胞内的复制,但是增加BIM的表达。TLR3表达水平的改变不影响MyD88的表达；MyD88表达水平的改变不影响IRF7的表达。TLR3、MyD88和IRF7的表达改变都会影响IFNa/β、Akt3、Bad、Bcl2以及BIM的表达水平。这些结果表明,ETYECs通过TLR3-IRF7-IFNal/β1和Myd88-IRF-7-IFNα1/β1两种途径诱导干扰素的产生。PI3K-Akt和TLR信号通路之间有关联。2) PI3K-Akt通路验证。以Akt-X抑制Akt后24小时攻毒,其下游基因的表达受抑制,IFNα1/β1的表达增加,病毒的复制并抑制。这些数据证实,PI3K-Akt通路参加了ETYECs的抗病毒过程。3)以Akt-X处理细胞24小时后,再干扰MyD8824后攻毒。结果表明病毒复制被中断。IRF7、IFNα1/β1、Akt3\Bad、Bcl2以及BIM的表达均受到影响。这表明在ETYECs中,PI3K-Akt和TLR信号通路参与抗病毒过程。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S821
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本文编号：2435323