Gga-miR-103-3p，gga-miR-130a和linc-GALMD3在鸡马立克氏病肿瘤形成过程中作用机制研究

发布时间：2019-03-08 19:19

【摘要】：鸡马立克氏病(Marek's disease,MD)是马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)感染后引起的一类高度传染性的T淋巴瘤细胞增生的肿瘤疾病,给家禽生产带来了巨大的经济损失。本研究利用MD肿瘤模型研究了miRNAs和lincRNAs在马立克氏病肿瘤形成过程的作用机制。前期通过Solexa测序发现gga-miR-103-3p和gga-miR-130a在MDV感染组织中显著下调。本试验用荧光定量的方法验证了gga-miR-103-3p和gga-miR-130a在MDV感染的脾脏肿瘤、肝脏来源的淋巴瘤、未感染的脾脏和未感染的肝脏中的表达。利用TargetScan和miRDB预测gga-miR-103-3p和gga-miR-130a的靶基因并用GO进行富集分析,再采用双荧光素酶报告系统验证gga-miR-103-3p的6个候选靶基因和gga-miR-130a的9个候选靶基因的结合位点,结果显示,gga-miR-103-3p可结合CCNEl和TFDP2的mRNA 3'UTR, gga-miR-130a可结合1NSIG1,ACVR1,HOXA3和MDFIC的mRNA3'UTR.随后利用荧光定量和Western Blot的方法检测发现gga-miR-103-3p抑制CCNE1和TFDP2蛋白表达,降低CCNE1 mRNA表达,但不能调控TFDP2 mRNA表达:gga-miR-130a抑制HOXA3和MDFIC蛋白表达,但不影响它们mRNA表达。综上所述,CCNEl和TFDP2是gga-miR-103-3p的靶基因；HOXA3和MDFIC是gga-miR-130a的靶基因。细胞增殖和迁移试验显示gga-miR-103-3p抑制MDCC-MSB1细胞的迁移却不能明显影响细胞的增殖,gga-miR-130a抑制MDCC-MSB1细胞增殖和迁移。本试验从马立克氏病抗性品系63和易感品系72正反交后代攻毒MDV的CD4+T细胞中首次鉴定出linc-GALMD3,其在两个正反交后代MDV感染的CD4+T细胞中表达上调。利用降落PCR和Sanger测序的方法证实了linc-GALMD3在CD4+T细胞和MDCC-MSB1细胞中序列一致,因此,MDCC-MSB1细胞可用来探索linc-GALMD3在MD肿瘤形成过程中的作用机制。设计合成shRNA沉默MDCC-MSB 1细胞中linc-GALMD3的表达,结果显示shRNA3-1657的干扰效率最高(53%)。利用shRNA3-1657干扰MDCC-MSB 1细胞中linc-GALMD3的表达,并用RNA-Seq检测干扰前后转录本变化,发现748个差异表达基因(FDR0.01)。利用GO和KEGG通路分析探究748个差异表达基因的生物学功能,结果显示差异基因显著聚集到12个生物学过程,19个细胞内组分组成和2个分子功能条目,主要涉及细胞周期、线粒体和核苷酸结合等。此外,大部分差异基因显著富集到亨廷顿疾病、帕金森疾病和阿兹海默病等神经退行性疾病通路中,8个基因在三个疾病通路中均被发现,可参与线粒体功能紊乱中氧化磷酸化作用,与多种癌症的发生相关。综上所述,本研究验证了gga-miR-103-3p和gga-miR-130a与其对应靶基因作用,并探索了其对淋巴细胞增殖和迁移的影响。Linc-GA LMD3在鸡马立克氏病中首次被发现,并与其表达相关的748个差异基因共同参与马立克氏病肿瘤形成过程。本研究为探索非编码RNA在马立克氏病肿瘤发生的作用机制提供了重要的数据资源和理论依据,也为遗传抗性研究奠定了良好的基础。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
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本文编号：2437126