甘蓝型油菜应答干旱胁迫的组学研究

发布时间：2019-04-02 08:54

【摘要】：油菜是重要的油料作物,在早期营养生长阶段对水分的缺失尤为敏感。为了阐明甘蓝型油菜应答干旱胁迫的分子机理,本研究以干旱敏感程度不同的甘蓝型油菜2AF009、3DH020和2AF410为实验材料,系统调查了甘蓝型油菜在干旱胁迫下的生理生化变化及分子应答机制,构建了甘蓝型油菜耐旱的调控网络、挖掘抗旱相关的基因并进行功能验证。主要研究结果下:1.甘蓝型油菜响应干旱胁迫的生理生化变化在干旱胁迫下,甘蓝型油菜2AF009比2AF410和3DH020失水速率更慢,相对含水量降低的更少,脯胺酸含量积累的更多,叶绿素a和b的含量更高。试验数据表明,2AF009比2AF410和3DH020具备更强的干旱适应能力。因此,选取2AF009进行后续转录组学和蛋白组学研究。2.甘蓝型油菜在干旱胁迫条件下的转录组分析利用RNA-seq技术对干旱处理组和对照组的油菜叶片进行转录组比较分析,共筛选出7379个显著差异表达的基因,其中包括3072个上调表达基因和4307个下调表达基因。COG功能分析发现,差异表达基因共可归为25类,与转录相关的基因数量最多,其次是与碳代谢、信号转导及翻译后修饰相关的基因。GO分析发现差异表达基因主要富集在与胁迫响应、磷代谢、激素刺激以及渗透胁迫响应相关的生物学过程,亚细胞定位主要在细胞质和细胞膜上。KEGG分析表明,差异基因共参与到55条显著代谢通路,包括淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、植物昼夜节律、苯丙氨酸生物合成、谷胱甘肽代谢等途径,这些都是与甘蓝型油菜干旱胁迫响应密切相关的代谢途径。鉴定了292个编码转录因子的转录本,包括MYB、b HLH、NAC、WRKY、AP2-EREBP、b ZIP、HSF等转录因子家族基因成员被大量的诱导表达。表明上游调控元件参与了干旱胁迫的响应。3.甘蓝型油菜应答干旱胁迫的比较蛋白组学分析利用荧光差异双向电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)结合质谱技术对不同程度干旱胁迫下的油菜叶片进行比较蛋白组学分析,共鉴定了138个干旱应答的差异丰度蛋白点,代表98种不同的蛋白。其中,轻度干旱胁迫鉴定了85个蛋白,重度干旱胁迫鉴定了107个蛋白。功能分析显示,干旱应答蛋白大部分与翻译后修饰、能量代谢和碳水化合物有关,主要定位在叶绿体和细胞质上。值得注意的是,其中35个蛋白点鉴定了20种不同的蛋白,每种蛋白包含了2到8个等电点和分子量不同的蛋白点,可能是由于蛋白异构型或者翻译后修饰造成的,βCA1是一类数量最多的蛋白,包含了相同分子量不同等电点的8个蛋白点。利用定量PCR技术分析甘蓝型油菜蛋白的基因表达规律发现,部分干旱应答蛋白的表达丰度与其基因水平上的表达变化密切相关,表明这部分基因在干旱处理后其表达调控发生在转录水平上。而一些蛋白在干旱处理后其表达变化规律与其转录水平的表达变化完全不同,可能是翻译后修饰在调控这些基因的功能中发挥重要作用。4.甘蓝型油菜应答干旱胁迫的磷酸化蛋白组学分析为获得甘蓝型油菜应答干旱胁迫的磷酸化修饰信息,提取了不同干旱处理的甘蓝型油菜叶片总蛋白,酶解后进行磷酸化肽段富集和LC-MS/MS质谱鉴定。最终鉴定了4469个磷酸化肽,来自1232个磷酸化蛋白。以|log2Ratio|≥1且p0.05为标准进行差异磷酸化蛋白的筛选,共鉴定了磷酸化水平上具有显著差异的337个磷酸化蛋白和547个磷酸化位点。其中,226个磷酸化蛋白是应答轻度干旱胁迫,268个是应答重度干旱胁迫。功能分析表明,显著差异的磷酸化蛋白主要富集在非生物胁迫刺激和信号转导等生物学过程,具有蛋白激酶活性或磷酸转移酶活性。COG功能分类结果显示,甘蓝型油菜中大部分的差异磷酸化蛋白功能未知,需要进一步研究。整合转录组和蛋白组的KEGG途径分析发现淀粉和蔗糖代谢途径在差异基因、差异蛋白和差异磷酸化蛋白中富集,共包括淀粉合成酶、淀粉酶、海藻糖磷酸合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶和葡萄糖磷酸变位酶11个酶。这些酶可能是通过磷酸化修饰作用协调植物在受到干旱胁迫时的代谢过程和生理生化反应。5.βCA1的综合分析在m RNA水平,βCA1基因在干旱处理下上调表达。在蛋白水平,8个不同βCA1的蛋白点应答干旱胁迫时表达不一致。翻译后修饰水平上,βCA1蛋白的Tyr207在干旱诱导下发生去磷酸化修饰。对碳酸酐酶的活性测定发现,干旱处理下碳酸酐酶的活性降低,与βCA1在Tyr207位点的去磷酸化修饰程度一致。这些结果表明蛋白质活性和磷酸化修饰之间似乎有着很强的相关性,暗示着βCA1可能通过磷酸化修饰调整酶活性最终协调植物的代谢过程从而适应干旱胁迫。通过同源性建模构建了βCA1的三维结构,发现磷酸化位点Tyr207位于底物结合活性中心。表明Tyr207磷酸化/去磷酸化的变化可能影响碳酸酐酶和底物的结合能力。由此得出,Tyr207可能是影响碳酸酐酶活性的重要的磷酸化位点。通过NCBI序列比对发现该基因与拟南芥中的At3g1500同源性最高。6.干旱胁迫条件下拟南芥βCA1突变体的表型观察观察干旱胁迫下突变体的表型发现,对比野生型拟南芥,βCA1突变体离体叶片失水率更高,根长更短,表现较强的干旱敏感性。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S565.4

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