【摘要】：以虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、花鲈(Lateolabrax japonicus)和大黄鱼(Larimichthvs crocea)分别代表淡水、广盐性和海水肉食性鱼类,研究三种不同适盐性类型的肉食性鱼受植物油影响的差异,以及体内A6脂肪酸去饱和酶调控差异。本文主要研究内容和结果如下：1.饲料中植物油替代鱼油对虹鳟、花鲈和大黄鱼幼鱼生长、脂肪酸组成、脂肪沉积和组织结构的影响以初始体重分别为(11.24±0.07g)、(18.6±0.36g)和(8.93±0.21 g)的虹鳟、花鲈和大黄鱼幼鱼为研究对象,通过70d的摄食生长实验,研究植物油(亚麻籽油：豆油=1：1)分别替代0%(FO,对照组)、50%(FV)和100%(VO)的鱼油对不同适盐性鱼类生长性能、脂肪酸组成、脂肪沉积和组织结构的影响。实验结果表明,植物油替代50%和100%的鱼油后不影响虹鳟的摄食、生长、饲料效率和成活率,花鲈和大黄鱼的上述指标随植物油替代水平的升高而显著降低。三种鱼的肝指数不受饲料处理的显著影响,但内脏指数随着植物油替代鱼油水平的升高而增加,且花鲈和大黄鱼的肝脏脂肪含量随植物油替代鱼油水平的升高而显著升高。随着植物油替代鱼油水平的升高,三种鱼肌肉中的n-3 LC-PUFA的含量逐渐降低,但在虹鳟中,鱼油组和50%植物油替代组中n-3 LC-PUFA的含量无显著差异,而在肝组织中50%植物油替代组和植物油组没有显著差异,均显著低于鱼油组。随着替代水平升高,虹鳟、花鲈和大黄鱼的肝细胞中脂肪滴累积程度逐渐增高,相同替代水平下大黄鱼肝细胞中脂肪滴累积程度最为严重；肠道组织中杯状细胞随植物油替代水平升高而增多,而在大黄鱼全植物油组出现脂肪滴累积和上皮细胞死亡现象。2.虹鳟、花鲈和大黄鱼△6FAD的基因启动子克隆和生物信息学分析利用基因步移方法,克隆到虹鳟、花鲈和大黄鱼的A6FAD启动子序列,长度分别为：1479 bp、2064 bp和996 bp。 Blast比对显示三种鱼的A6FAD启动子序列与已提交NCBI的鱼类△6FAD序列具有较高的保守性。多序列比对显示,三种鱼与大西洋鲑和欧洲鲈鱼含有相同的转录因子结合位点NF-Y和SRE,但在虹鳟、鲈鱼和大黄鱼△6FAD启动子中均未发现大西洋鲑所具有SP1结合位点。3.虹鳟、花鲈和大黄鱼转录因子SREBP-1和PPAR-β的cDNA全长克隆以及生物信息学分析分别克隆得到虹鳟、化鲈和大黄鱼的SREBP-1基因cDNA全长,其长度分别为4220 bp、3797 bp和3750 bp。通过BLAST分析发现,虹鳟、花鲈和大黄鱼的SREBP-1序列与已知鱼类的SREBP-1具有较高的同源性,通过与人类SREBP-1的N端进行比对发现,鱼类的SREBP-1与人类的SREBP-1a的相似度大于人类的SREBP-lc。SREBP-1的系统进化树分析结果与传统的分类学结果一致。PPAR-α基因在虹鳟和花鲈中有两个亚型,而在大黄鱼中只存在一个。通过BLASTP分析和多序列比对,发现PPAR-α1和PPAR-α2均与哺乳类具有较高同源性,具有相同的DNA-binding domain和ligand-binding domain结合位点。构建PPAR-α的系统进化树发现,该进化树明显地分为两支,拥有两种PPAR-α基因的鱼类,如花鲈、斑马鱼等,其两个基因分别在进化树的不同分枝上。这说明在鱼类进化过程中,PPAR-α基因在部分鱼类中发生了基因重复,可能基因亚型的功能也因此发生了分化。4.饲料中植物油替代鱼油对虹鳟、花鲈和大黄鱼Δ6FAD、SREBP-1和PPAR-α的mRNA表达的影响。随着植物油替代鱼油水平的升高,虹鳟、花鲈和大黄鱼Δ6FAD、SREBP-1和PPAR-α在肝脏中的mRNA表达逐渐升高,但在肌肉、脂肪和肠道组织中存在不同的结果。这可能是因为鱼体的不同组织对植物油响应的程度以及脂肪酸的合成能力存在差异。植物油替代鱼油后也促进了三种鱼组织中SREBP-1的表达量,但在虹鳟的脂肪和肠道中，以及花鲈的肝脏和肌肉中出现了SREBP-1基因的mRNA表达量随着替代水平升高先降低再升高的趋势。在虹鳟和人黄鱼肝脏中植物油替代鱼油导致PPAR-α基因表达量升高,但是在花鲈的肝脏和肌肉中,却出现了植物油抑制PPAR-α基因表达的现象,所以PPAR-α基因对植物油的响应在不同鱼类中具有不同的效果。在花鲈肠道组织和大黄鱼的肝脏和肌肉组织中,△6FAD分别与SREBP-1和PPAR-α的表达量存在显著的正相关关系。5.虹鳟、花鲈和大黄鱼中转录因子SREBP-1和PPAR-α基因对A6FAD的调控作用在以上研究的基础上,将三种鱼的转录因子开放阅读框分别连入载体PCS2+,构建表达质粒；将三种鱼的A6FAD基因启动子序列分别连入PGL3-Basic质粒中,构建报告质粒。将重组质粒PCS2-和PGL3-共转染入HEK293T细胞中,通过检测双荧光素酶活性的比值来探讨转录因子对A6FAD启动子的调控活性的强弱。启动子活性比较结果发现,虹鳟A6FAD启动子的活性显著高于花鲈和大黄鱼。在三种鱼中转录因子SREBP-1对A6FAD启动子都具有激活作用,但是激活程度具有差异,在虹鳟和大黄鱼中激活程度约1.6倍,在花鲈中高达4.6倍。在三种鱼类中,转录因子PPAR-α对A6FAD启动子的具有不同的激活活性：在虹鳟中,只有PPAR-α2基因对A6FAD启动子具有1.3倍的激活作用；在花鲈中PPAR-α1和-α2对A6FAD启动子都具有激活作用,但激活的程度不高；在大黄鱼中PPAR-α对A6FAD启动子没有显著的激活作用。为进一步验证转录因子SREBP-1和PPAR-α对A6FAD的调控作用,虹鳟中开展了RNA干扰实验。实验结果表明,虹鳟中转录因子SREBP-1和PPAR-α2的siRNA都成功干扰了相应基因的表达,并分别在干扰后4h和6h表达量达到最低。伴随着转录因子表达量降低,A6FAD的表达也出现降低,并在转录因子SREBP-1和PPAR-α2表达量下降到最低点后的2h和6h达到表达最低水平。以上结果再次证明,虹鳟中SREBP-1和PPAR-α2对A6FAD的转录调控起到了正向激活的作用。
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
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本文编号：2516485
