枯草杆菌蛋白酶基因6在须癣毛癣菌致病性中的功能研究

发布时间：2017-03-17 22:08

  本文关键词：枯草杆菌蛋白酶基因6在须癣毛癣菌致病性中的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)是一种亲角质的致病真菌,可以感染人和动物,并互相传播。须癣毛癣菌分泌多种蛋白酶来分解表皮组织,同时为其在角质上的生长和增殖获取营养物质。此外,分泌的角蛋白酶还可引发宿主的细胞和体液介导的免疫反应。一个编码丝氨酸蛋白酶的、由7个基因所组成的基因家族--枯草杆菌蛋白酶基因家族(SUBs)已经在须癣毛癣菌中被分离出来。其中SUB6基因相关的毛癣菌素蛋白Tri r2,可以同时引发宿主的速发型和迟发型超敏反应,而SUB6基因与其在体内外分泌的调控作用尚未可知。对于研究一个潜在的毒力基因最简便有效的方法就是通过定点基因敲除后分析突变株表型和致病性的变化,即反向遗传学的方法。目前,根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)是最常应用于真菌基因敲除的方法,其已经成功的应用于多种丝状真菌的遗传转化。目的通过ATMT法将须癣毛癣菌SUB6基因敲除后,对突变株的表型、生长速率、角蛋白酶活性、角蛋白酶基因表达及对动物机体的致病性变化进行分析,以研究该基因的功能。方法构建含有SUB6基因同源片段及潮霉素抗性标记基因的双元载体pDHt/SUB6-ⅠⅡ::hph,将其转化进入根癌农杆菌后,在一定的条件下与须癣毛癣菌分生孢子共培养实现基因敲除的目的,并通过PCR和Southern blot的方法对得到的转化子进行鉴定。观察突变株表型、生长速率,测定体外角蛋白酶活性,并通过实时荧光定量PCR的方法对角蛋白酶相关基因的转录水平进行检测。通过将突变株接种实验动物,观察其引发的临床及病理变化,并使用ELISA的方法测定接种动物脾匀浆中特异性免疫相关的细胞因子水平。结果通过PCR以及Southern blot的验证,确认须癣毛癣菌SUB6基因被潮霉素抗性标记基因通过同源重组方式定点敲除。与须癣毛癣菌标准株相比,SUB6基因突变株的金属蛋白酶基因(MEP)4和SUB3基因表达量显著升高,体外角蛋白酶活性显著增强；而被SUB6基因突变株感染的实验动物则表现为较轻程度的临床症状和病理变化,其免疫抑制因子IL-10在突变株感染后表现为持续高水平的分泌,而与迟发型超敏反应相关的细胞因子IFN-γ, TNF-α和IL-12分泌水平的升高则表现为出现相对较晚,且增幅较低。结论须癣毛癣菌SUB6基因可以通过ATMT体系进行敲除,成功获得可以稳定遗传的单拷贝、同源重组的SUB6基因缺失菌株：须癣毛癣菌SUB6基因功能与引发机体免疫反应相关,其突变株所引发动物机体的免疫反应发病时间较晚,病变程度较弱,致病性降低；须癣毛癣菌角蛋自酶相关基因的联动调控作用使得SUB6基因缺失株的体外角蛋白酶活性增加,且该突变菌株并未完全失去致病性。
【关键词】：须癣毛癣菌 SUB6 ATMT 致病性
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 英文缩略词9-10
• 第一章 引言10-21
• 1.1 皮肤癣菌及皮肤癣菌病10
• 1.2 须癣毛癣菌的基本概况10-12
• 1.2.1 分类及形态10-11
• 1.2.2 流行病学11
• 1.2.3 致病机制和毒力因子11-12
• 1.3 枯草杆菌蛋白酶(Sub)研究概况12-13
• 1.4 皮肽癣菌的免疫应答13-15
• 1.5 真菌的基因敲除15-18
• 1.5.1 PEG-CaCl_2介导的遗传转化16
• 1.5.2 电激法介导的遗传转化16
• 1.5.3 转座子介导的遗传转化16
• 1.5.4 限制性内切酶介导的遗传转化(Restriction Enzyme-MediatedIntegration-REMI)16-17
• 1.5.5 根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens MediatedTransformation-ATMT)17-18
• 1.6 须癣毛癣菌的毒力研究18-20
• 1.6.1 蛋白酶活力18
• 1.6.2 毒力基因表达18-19
• 1.6.3 动物试验19-20
• 1.7 本研究的目的与意义20-21
• 第二章 须癣毛癣菌SUB6基因的克隆与双元载体的构建21-45
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 菌株和质粒21
• 2.1.2 主要试剂21-22
• 2.1.3 试剂的配制22-23
• 2.1.4 主要仪器23-24
• 2.2 方法24-34
• 2.2.1 须癣毛癣菌SUB6基因克隆与测序24-26
• 2.2.2 用于ATMT转化的双元载体的构建26-34
• 2.3 结果34-43
• 2.3.1 须癣毛癣菌SUB6基因测序结果34-35
• 2.3.2 质粒pAN7-1/SUB6-Ⅰ的鉴定结果35-39
• 2.3.3 质粒pDHt/SUB6-ⅠⅡ::hph鉴定结果39-43
• 2.4 讨论43-44
• 2.5 小结44-45
• 第三章 根癌农杆菌介导须癣毛癣菌SUB6基因的遗传转化45-64
• 3.1 材料45-50
• 3.1.1 菌株和质粒45
• 3.1.2 主要试剂45-46
• 3.1.3 试剂和培养基的配制46-49
• 3.1.4 主要仪器49-50
• 3.2 方法50-55
• 3.2.1 双元载体的转化50-51
• 3.2.2 须癣毛癣菌的药敏试验51
• 3.2.3 须癣毛癣菌SUB6基因的ATMT转化51
• 3.2.4 阳性转化子的筛选与鉴定51-55
• 3.3 结果55-61
• 3.3.1 双元载体转化结果55-56
• 3.3.2 须癣毛癣菌ATCC 28185对潮霉素B敏感性试验56
• 3.3.3 ATMT转化结果与效率56-57
• 3.3.4 转化子的鉴定结果57-61
• 3.4 讨论61-63
• 3.5 小结63-64
• 第四章 须癣毛癣菌SUB6基因缺失株△SUBs的毒力研究64-89
• 4.1 须癣毛癣菌SUB6基因缺失株△SUB6s的体外角蛋白酶活性试验64-68
• 4.1.1 材料64-65
• 4.1.2 方法65-66
• 4.1.3 结果66-67
• 4.1.4 讨论67-68
• 4.2 须癣毛癣菌SUB6基因缺失株△SUB6s的体外角蛋白酶基因表达试验68-76
• 4.2.1 材料68-69
• 4.2.2 方法69-73
• 4.2.3 结果73-75
• 4.2.4 讨论75-76
• 4.3 须癣毛癣菌SUB6基因缺失株△SUB6s的动物接种试验76-88
• 4.3.1 材料76-78
• 4.3.2 方法78-79
• 4.3.3 结果79-86
• 4.3.4 讨论86-88
• 4.4 小结88-89
• 第五章 结论与创新点89-90
• 5.1 结论89
• 5.2 创新点89-90
• 参考文献90-97
• 附录97-102
• 致谢102-104
• 个人简介104-105

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本文编号：253530