梨PbFWLs和PsPL基因的克

发布时间：2017-03-17 22:08

  本文关键词：梨PbFWLs和PsPL基因的克隆、表达与功能初步分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：梨(Pyrus spp)是继葡萄和苹果后,世界上第三大温带水果。在梨的生产栽培过程中,果实大小是果品分级和果园经济效益的主要决定因素,果实硬度与果实口感、货架期长短息息相关。分析影响果实大小、硬度的内在原因、掌握基因对果实大小、硬度的调控机制对选择优良基因型品种、建立育种计划、提高果实商品性有很大帮助。本研究以小果型野生杜梨、中果型栽培种香梨和大果型栽培种鸭梨为试验对象,通过组织解剖学研究了果实细胞大小、数目与梨果实大小的关系;利用同源克隆的方法分离了两个梨fw2.2同源基因,对其进行了生物信息学、亚细胞定位以及表达分析,并在超表达转基因植株中进行了功能验证;分离了PL同源基因,并对其进行了生物信息学、表达分析及原核表达。为进一步研究控制梨果实大小与硬度的分子机理提供理论依据。主要研究结果如下:1.香梨和鸭梨果实单果重、体积生长曲线均为单S型,呈“慢-快-慢”趋势,杜梨果实在整个生长发育过程中生长缓慢,果实生长动态几乎为一条直线,S型曲线特征不明显。香梨和鸭梨的纵横径生长动态曲线类似S型,而杜梨纵横径生长动态为缓慢增长的直线。前期香梨和鸭梨果实纵径生长比横径生长快;后期香梨和鸭梨果实横径生长要比纵径生长快,杜梨果实纵横径生长速率基本一致且增长缓慢。2.通过对梨果实不同时期纵横径切片观察发现:三个梨品种果肉组织细胞生长动态大致相似,果肉组织细胞体积在不同时期大小一致,其中香梨和鸭梨果肉组织细胞增大的动态与果实重量和果实体积的生长动态基本同步。计算果实细胞数目发现:梨品种间大小差异是由细胞数目决定的,而不是细胞体积。3.利用同源克隆方法,通过RT-PCR和RACE技术,成功分离了梨两个fw2.2同源基因,命名为PbFWL1与PbFWL2。PbFWL1编码了214个氨基酸,分子量约为24.067 kDa,理论等电点pI为6.25,分子式为C1042H1568N296O316S24;PbFWL2编码了208个氨基酸,分子量约为23.076 kDa,理论等电点pI为5.67,分子式为C1004H1514N272O311S22,两个蛋白均为亲水性蛋白。PbFWL1与PbFWL2蛋白之间的同源性为82.71%,与番茄FW2.2蛋白的同源性分别为44.39%和44.23%。两个蛋白都含有PLAC8保守结构域和CCXXXXCPC模序。三个梨品种的PbFWLs cDNA序列完全一致。4.在三个梨品种果实生长发育过程中,PbFWLs mRNA水平在各个时期总体表现为小果高于大果的趋势。鸭梨PbFWL1除了在135 DAFB表达量较高,在其余时期的表达量和PbFWL2的表达量均保持在一个很低的水平;杜梨的PbFWL1与PbFWL2表达量均为最高,但是在一些时期和香梨的表达量差异不大。PbFWLs基因表达量的上升与下降没有特别的规律,但是在果实细胞分裂时期,PbFWL1与PbFWL2表达量均为杜梨香梨鸭梨,与梨果实大小呈负相关关系。5.将PbFWLs基因全长cDNA序列插入到pCAMBIA1304双元表达载体的BglⅡ与SpeⅠ限制性内切酶位点之间,构建成瞬时表达载体pCAMBIA1304-PbFWLs。用农杆菌介导法将构建好的质粒导入洋葱表皮细胞中。荧光共聚焦显微镜观察显示:在波长为480 nm光源激发下,含有定位信号肽的pCAMBIA1304-PbFWL1和pCAMBIA1304-PbFWL2都在细胞膜上检测到了荧光信号,而在细胞核、细胞质上未检测到荧光信号,说明pCAMBIA1304-PbFWLs主要存在于在细胞膜上,可能为膜蛋白。6.构建了PbFWLs基因植物超表达载体pCAMBIA1303-PbFWLs,浸花法转化拟南芥,成功获得PbFWLs转基因植株,结果发现:PbFWL1过量表达的T2代转基因植株地上部分的组织、器官略比对照植株小,地下部分无明显差异;PbFWL2过量表达的T2代转基因植株大小与对照植株无差异。7.利用同源克隆方法,通过RT-PCR和RACE技术,分离了香梨PL同源基因,命名为PsPL。PsPL编码了414个氨基酸,分子量约为45.17 kDa,理论等电点pI为6.78,分子式为C1977H3084N574O604S21,为不稳定蛋白。该蛋白质属于果胶裂解酶家族基因,含有一个右手β螺旋结构与苹果PL蛋白的同源性最高,达97%8.将PsPL基因全长cDNA序列插入到pET28a(+)原核表达载体的BamHⅠ与HindⅢ限制性内切酶位点之间,构建成原核表达载体pET-PsPL。在BL21大肠杆菌内,经1.0 mmol/L IPTG诱导,37℃220 rpm 2 h就可以大量表达,且随着时间的延长,表达的蛋白量差异不大。9.从香梨果实生长发育后期到货架期,果实硬度不断下降;PsPL的表达水平呈先升高后下降的趋势,没有和香梨果实软化同步,推测PsPL可能在香梨完全成熟后才大量表达。
【关键词】：梨 fw2.2 PL 果实大小 果实硬度 亚细胞定位 表达分析 功能验证
【学位授予单位】：新疆农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S661.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词8-14
• 第1章 绪论14-27
• 1.1 梨果实生长发育特性的研究14-15
• 1.2 梨果实大小研究进展15-19
• 1.2.1 梨果实大小遗传的研究进展15-16
• 1.2.2 授粉品种对梨果实大小影响16-17
• 1.2.3 套袋对梨果实大小的影响17
• 1.2.4 不同花序对梨果实大小的影响17-18
• 1.2.5 施肥对梨果实大小的影响18-19
• 1.2.6 植物生长调节剂对梨果实大小的影响19
• 1.3 控制果实大小相关基因研究进展19-23
• 1.3.1 fw2.2 基因的研究进展20-21
• 1.3.2 CDK基因的研究进展21-22
• 1.3.3 其他基因的研究进展22-23
• 1.4 果实软化相关酶的研究进展23-25
• 1.4.1 多聚半乳糖醛酸酶（PG）的研究进展23-24
• 1.4.2 果胶甲脂酶（PME）的研究进展24-25
• 1.4.3 果胶裂解酶（PL）的研究进展25
• 1.5 本文的研究背景及目的意义25-27
• 第2章 梨果实发育动态研究27-35
• 2.1 材料与方法27-28
• 2.1.1 试验材料27
• 2.1.2 方法27-28
• 2.2 结果与分析28-33
• 2.2.1 梨果实质量、体积生长发育动态28-29
• 2.2.2 梨果实纵、横径的生长发育动态29-30
• 2.2.3 果实发育过程中细胞体积及细胞数目的变化动态30-33
• 2.3 小结与讨论33-35
• 2.3.1 梨果实生长发育动态与果实大小的关系33
• 2.3.2 梨果实细胞体积、数量与果实大小的关系33-34
• 2.3.3 如何促进梨果实增大34-35
• 第3章 PBFWLS基因的克隆及其序列分析35-55
• 3.1 材料与方法35-41
• 3.1.1 试验材料35
• 3.1.2 方法35-41
• 3.2 结果与分析41-52
• 3.2.1 梨果肉组织RNA的提取与鉴定41
• 3.2.2 PbFWLs基因中间片段的获得41-42
• 3.2.3 PbFWLs全长cDNA的获得42-43
• 3.2.4 PbFWLs基因生物信息学分析43-52
• 3.3 小结与讨论52-55
• 第4章 PBFWLS基因的表达及亚细胞定位55-66
• 4.1 材料与方法55-58
• 4.1.1 试验材料55
• 4.1.2 方法55-58
• 4.2 结果与分析58-64
• 4.2.1 PbFWLs在三个不同品种梨果肉组织中的表达分析58-60
• 4.2.2 pCAMBIA1304-PbFWLs重组表达载体的构建与检测60-62
• 4.2.3 PbFWLs亚细胞定位分析62-64
• 4.3 小结与讨论64-66
• 4.3.1 PbFWLs表达水平与果实大小的关系64-65
• 4.3.2 PbFWLs的亚细胞定位及功能分析65-66
• 第5章 PBFWLS基因功能初步鉴定66-76
• 5.1 材料与方法66-69
• 5.1.1 试验材料66
• 5.1.2 方法66-69
• 5.2 结果与分析69-73
• 5.2.1 pCAMBIA1303-PbFWLs重组表达载体的构建与检测69-70
• 5.2.2 T_1代植株的筛选70-71
• 5.2.3 T_1代植株的PCR检测71
• 5.2.4 T_2代植株的表型观察71-73
• 5.3 小结与讨论73-76
• 第6章 PSPL基因的克隆及原核表达76-91
• 6.1 材料与方法76-79
• 6.1.1 试验材料76
• 6.1.2 方法76-79
• 6.2 结果与分析79-89
• 6.2.1 PsPL基因中间片段的获得79-80
• 6.2.2 PsPL全长cDNA的获得80
• 6.2.3 PsPL基因生物信息学分析80-87
• 6.2.4 pET-PsPL重组表达载体的构建与检测87-88
• 6.2.5 PsPL在大肠杆菌中的原核表达和SDS-PAGE电泳分析88-89
• 6.3 小结与讨论89-91
• 第7章 香梨果实硬度测定及PSPL基因表达分析91-95
• 7.1 材料与方法91-92
• 7.1.1 试验材料91
• 7.1.2 方法91-92
• 7.2 结果与分析92-93
• 7.2.1 不同时期香梨果实硬度分析92
• 7.2.2 PsPL在不同时期香梨果肉组织中的表达分析92-93
• 7.3 小结与讨论93-95
• 第8章 结论与展望95-97
• 8.1 结论95-96
• 8.2 创新与展望96-97
• 参考文献97-114
• 附录114-116
• 致谢116-117
• 作者简历117

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 吴兴泉,陈士华,吴祖建,林奇英,谢联辉;马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析[J];中国病毒学;2003年04期

2 任冲;李伟;;PL型喷油泵的拆装和调整技术规范[J];农机使用与维修;2011年02期

3 任冲;曹世富;;PL型喷油泵调试工艺技术规范[J];农机使用与维修;2011年01期

4 王永庄;孙质蕙;李丽秀;;平菇PL_(45)菌株的生物学特性及栽培要点[J];天津农业科学;1991年02期

5 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 宋希敏;乔丽侠;;耐火材料、磨料行业细碎、粗磨新型力口工设备——PL型立式冲击破碎机及加工工艺流程[A];第六届全国颗粒制备与处理学术会议论文集[C];2000年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 梦剧;索尼发布全新4K摄影机和PL镜头系统[N];中国摄影报;2012年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 田嘉;梨PbFWLs和PsPL基因的克隆、表达与功能初步分析[D];新疆农业大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 于春淼;PL物业管理公司发展战略研究[D];哈尔滨工程大学;2007年

2 王海旭;氧化对硅锗合金低维结构PL发光的影响[D];贵州大学;2009年

3 郑海华;封闭式婴幼儿PL视力检测仪的试制与临床初步应用[D];浙江大学;2002年

  本文关键词：梨PbFWLs和PsPL基因的克隆、表达与功能初步分析，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：253528