化学杂交剂单嘧磺酯钠诱导甘蓝型油菜雄性不育分子机制的初步研究

发布时间：2017-03-18 07:04

  本文关键词：化学杂交剂单嘧磺酯钠诱导甘蓝型油菜雄性不育分子机制的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：油菜杂种优势显著,化学杀雄已成为油菜杂种优势利用的有效途径之一。已有研究发现少数几种磺酰脲类除草剂在低浓度时可以作为化学杀雄剂用于油菜杂交育种;但迄今关于化学杂交剂(Chemical Hybridization Agent,CHA)诱导植物雄性不育的机理却知之甚少,这严重阻碍化学杀雄技术的应用以及新的杀雄剂的开发。为揭示本课题组新近开发的CHA-单嘧磺酯钠(Monosulfuron Ester Sodium,MES)诱导甘蓝型油菜雄性不育的分子机理,本研究首先观察了对照可育组和CHA-MES诱导不育组花药绒毡层细胞和花粉母细胞的超微结构变化;然后利用油菜表达谱芯片技术分析了正常情况下油菜花药发育过程中转录组的变化情况;同时对可育和不育花药的差异转录组进行了分析,筛选出一系列不育相关候选基因;最后利用病毒介导的基因沉默技术在拟南芥植株上验证候选基因与植物育性之间的关系。主要研究结果如下:1.通过对正常可育和CHA-MES诱导不育花药细胞的超微结构观察发现:在花粉母细胞时期,可育花药中多层细胞开始分化形成,绒毡层细胞和花粉母细胞保持着高度的分裂性;而MES诱导不育花药中,花粉母细胞则出现异常的细胞质壁分离现象。伴随着发育的进行,可育花药进入四分体时期,小孢子初级花粉外壁结构开始形成,同时伴随着绒毡层细胞向分泌型转化,出现大量的内质网结构;MES诱导不育花药中,多数细胞无法正常进行减数分裂,仅能观察到彼此分离的严重质壁分离的性母细胞。单核花粉粒时期,可育小孢子中形成一个大液泡以及丰富的细胞器结构,绒毡层细胞壁降解,细胞质融合,出现两种特殊的质体结构(造油体和绒毡层小体),向小孢子堆叠,进一步加固花粉外壁结构;MES诱导不育花药中,少量的细胞通过四分体时期进入单核花粉粒时期,但花粉粒中几乎无内容物,有的无法形成完整的花粉外壁。而绒毡层细胞也出现多种结构异常,如细胞壁不降解,细胞质无法融合;细胞质融合但不降解;造油体和绒毡层小体结构异常等等。成熟花粉粒时期,正常可育的二核或三核花粉粒中可见许多颗粒状的储存物质及丰富的内质网结构;而MES诱导不育花药中,花粉彻底败育,花粉粒空秕无内容物,绒毡层细胞残留物呈凝固块状,或为仍保留细胞壁的死细胞。此外,单核花粉粒时期的不育花药外皮层和内皮层中叶绿体结构也出现异常现象。因此,正常的油菜花药发育过程涉及到多种细胞和细胞器的参与,而CHA-MES处理则导致花粉母细胞、绒毡层细胞、以及药壁细胞的结构受到不同程度的破坏,尤其体现在质体结构的异常方面。2.通过对油菜正常可育植株叶片及不同发育阶段花药的转录组进行分析发现:在油菜花药发育过程中存在广泛的基因表达量的动态变化过程。通过对三个花药组织与叶片的比较,以及花药组织之间的两两比较,共筛选到11,678个差异表达转录本(differentiallyexpressedtranscripts,dets)。从这些dets的分布来看,在花药发育早期,dets数目较少,但其表达水平变化幅度较大,而后期,涉及到大量基因的转录水平调整。使用kmeans聚类方法将11,678个dets根据其在四个组织中的表达变化情况分成15种不同的表达模式(dominantpatterns,dps),每个dp中包含89到4319个dets。其中,dp1-dp5包含705个转录本,表现为在花药发育早期(sbs和an-mbs)时高表达,而dp6-dp12中包含的1,517个转录本在晚期花药(an-lbs)中高表达。对各dp中的转录本进行基因功能的go富集分析发现,与内膜系统相关的基因在花药发育早期和晚期均有富集(dp1,dp5,dp6,dp8,dp9)。此外,在花药发育早期(dp1-dp5),与花粉外壁形成和丙三醇代谢相关的基因被富集;而花药发育晚期(dp6-dp12),大量与细胞壁或果胶代谢相关的基因被富集。15个dp中涉及到的脂肪酸以及碳水化合物代谢相关基因分布情况显示,脂肪酸代谢相关基因主要在花药发育早期富集,而碳水化合物代谢相关基因则在后期富集。3.对正常可育和cha-mes诱导不育植株叶片及花药组织进行差异转录组分析:共筛选到1,501个受cha-mes影响的与油菜花药发育相关的dets,其中64%的dets在不育株中下调表达,36%上调表达。并且叶片(ls)和小花蕾(sbs)中检测到的dets数目较少(分别为77和67个);而中后期花蕾的花药(an-mbs和an-lbs)中则检测到相对较多的dets(161和1,238)。利用拟南芥同源基因对以上dets进行了功能注释。亚细胞定位分析发现大部分差异表达基因分布于质体/叶绿体、线粒体和细胞核中。基因功能分类和富集分析发现cha-mes处理主要影响了花药发育过程中与碳水化合物和脂肪酸代谢相关基因的表达。利用mapman软件进行的代谢途径分析也证实了以上结果。结合基因功能富集和代谢途径分析,筛选到了一系列与脂肪酸和碳水化合物代谢相关的差异表达基因,推测其可能与mes诱导油菜雄性不育紧密相关。最后,可育和不育植株叶片和花蕾中糖类物质含量的变化进一步证实了cha-mes处理的确影响了叶片和花蕾中碳水化合物的代谢。4.虽然有报道称磺酰脲类除草剂的作用靶标是乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,als),但该类除草剂作为杀雄剂使用时的基本作用机理尚未见报道。本研究利用拟南芥抗磺酰脲类除草剂突变体cs204为材料,验证了cha-mes诱导植物雄性不育的作用靶标同为als酶。同时,利用trv病毒介导的基因沉默体系(trv-vigs)干扰拟南芥植株体内的als基因表达,也可以获得雄性不育株,且随着als基因表达量下降程度的增加,植株出现严重的发育障碍。这与化学杀雄剂对植物生长发育的影响是相似的,即低浓度下诱导雄性不育,高浓度下严重抑制生长。此外,通过差异转录组分析我们得到了一系列可能与花药育性相关的基因,根据它们的表达情况及所涉及的功能,挑选了42个作为候选基因。利用TRV-VIGS技术在拟南芥中快速筛选与植物育性相关的基因,发现了2个可能与植物育性相关的基因。综上,本研究提出CHA-MES诱导甘蓝型油菜雄性不育的初步机理为:MES药物处理首先抑制了花药中ALS酶的活性,影响了植株花药中与碳水化合物和脂肪酸代谢相关基因的表达,导致油菜中精细代谢调控网络发生重排,质体及其他细胞器结构异常,最终导致雄性不育。也许正是因为花药发育对质体以及碳水化合物和脂肪酸代谢过程的需求程度明显高于其他组织,才造成油菜花药组织对低浓度的MES高度敏感,而其他组织则不敏感。
【关键词】：油菜 单嘧磺酯钠 雄性不育 超微结构 转录组 脂肪酸代谢 碳水化合物代谢 TRV-VIGS
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S565.4
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-16
• 第一章 文献综述16-38
• 1.1 油菜的杂种优势及其利用16-19
• 1.1.1 植物杂种优势利用16-17
• 1.1.2 油菜杂种优势利用途径17-19
• 1.2 植物化学杂交剂研究概况19-26
• 1.2.1 植物化学杂交剂诱导雄性不育研究的发展历史19-20
• 1.2.2 油菜化学杂交剂的的发展及使用现状20-23
• 1.2.3 杀雄剂单嘧磺酯钠的化学特性23-26
• 1.3 油菜雄性不育的发生机理26-31
• 1.3.1 高等植物花药发育过程26-27
• 1.3.2 油菜细胞质雄性不育的发生机理27-28
• 1.3.3 油菜细胞核雄性不育的发生机理28
• 1.3.4 油菜化学杀雄剂诱导的雄性不育28-31
• 1.4 植物花药转录组研究概况31-33
• 1.4.1 正常花药转录组研究概况31-32
• 1.4.2 不育花药与正常花药的比较转录组研究32-33
• 1.5 病毒介导的植物基因沉默技术及其应用33-37
• 1.5.1 VIGS技术的发现及应用34-35
• 1.5.2 烟草脆裂病毒介导的VIGS35-37
• 1.6 本研究的目的和意义37-38
• 第二章 CHA-MES对甘蓝型油菜花药发育的细胞学影响38-51
• 引言38
• 2.1 材料、试剂及仪器38-39
• 2.1.1 材料38
• 2.1.2 试剂及仪器38-39
• 2.2 实验方法39
• 2.2.1 供试材料的种植39
• 2.2.2 单嘧磺酯钠溶液的配制39
• 2.2.3 化学杀雄处理及样品采集39
• 2.2.4 透射电镜样品制备及观察39
• 2.3 结果与分析39-48
• 2.3.1 花粉母细胞时期对照组与处理组花药细胞超微结构比较40-41
• 2.3.2 四分体时期对照组与处理组花药细胞超微结构比较41-43
• 2.3.3 单核花粉粒时期对照组与处理组花药细胞超微结构比较43-45
• 2.3.4 成熟花粉粒时期对照组与处理组花药细胞超微结构比较45-47
• 2.3.5 单核花粉粒时期对照组与处理组花药外皮层和内皮层细胞超微结构比较47-48
• 2.4 讨论与结论48-51
• 第三章 甘蓝型油菜花药正常发育过程中的转录组分析51-73
• 引言51
• 3.1 材料、试剂及仪器51-52
• 3.1.1 植物材料51
• 3.1.2 试剂、仪器及软件工具51-52
• 3.2 实验方法52-54
• 3.2.1 供试植物材料的种植及样品采集52
• 3.2.2 RNA提取、芯片杂交、数据采集以及归一化处理52-53
• 3.2.3 基因表达的差异显著性分析及功能注释53
• 3.2.4 差异表达基因的聚类分析53
• 3.2.5 GO功能富集分析53-54
• 3.2.6 基因表达调控网络的预测54
• 3.2.7 实时定量PCR分析54
• 3.3 结果与分析54-69
• 3.3.1 甘蓝型油菜花药发育过程中各阶段转录组的检测54-57
• 3.3.2 甘蓝型油菜花药发育过程中各阶段转录组的动态变化情况57-59
• 3.3.3 甘蓝型油菜花药发育中差异表达基因的注释、聚类以及功能分析59-63
• 3.3.4 甘蓝型油菜花药发育中脂肪酸及碳水化合物代谢相关基因的表达变化63-67
• 3.3.5 甘蓝型油菜花药发育过程中的代谢调节网络分析67-68
• 3.3.6 Real-time PCR验证68-69
• 3.4 讨论与结论69-73
• 3.4.1 植物花药发育早期和晚期之间普遍存在着转录组的调整变化69-70
• 3.4.2 油菜花药转录组功能从早期的脂肪酸代谢到晚期的碳水化合物代谢转变70-71
• 3.4.3 油菜花药发育过程中的基因表达调控网络71-73
• 第四章 CHA-MES诱导甘蓝型油菜不育花药的差异转录组分析73-93
• 引言73
• 4.1 材料、试剂及仪器73-74
• 4.1.1 材料73-74
• 4.1.2 试剂及仪器74
• 4.2 实验方法74-76
• 4.2.1 供试植物材料的种植、MES处理及样品采集74-75
• 4.2.2 RNA提取、芯片杂交、数据采集以及归一化处理75
• 4.2.3 利用实时定量PCR方法验证基因芯片数据75
• 4.2.4 差异基因的筛选及功能注释75
• 4.2.5 差异基因的功能分类、富集分析以及代谢途径分析75-76
• 4.2.6 碳水化合物含量测定76
• 4.3 结果与分析76-89
• 4.3.1 CHA-MES诱导甘蓝型油菜雄性不育的差异表达基因筛选76-79
• 4.3.2 CHA-MES诱导甘蓝型油菜雄性不育差异表达转录本的注释及功能分析79-83
• 4.3.3 CHA-MES诱导甘蓝型油菜雄性不育株差异表达基因的代谢途经分析83
• 4.3.4 碳水化合物和脂肪酸代谢相关基因的表达量变化情况83-88
• 4.3.5 CHA-MES诱导油菜雄性不育植株叶片及花药中碳水化合物含量的变化88-89
• 4.4 讨论与结论89-93
• 4.4.1 CHA-MES可能通过影响质体和线粒体的结构而影响花药的育性89
• 4.4.2 CHA-MES影响花药发育过程中脂肪酸和碳水化合物代谢相关基因的表达89-90
• 4.4.3 CHA-MES诱导植物雄性不育过程与ALS抑制剂除草过程的比较90-92
• 4.4.4 推测CHA-MES诱导甘蓝型油菜发生雄性不育的工作模型92-93
• 第五章 CHA-MES诱导植物雄性不育靶标的验证及不育候选基因的筛选93-105
• 引言93
• 5.1 材料、试剂及仪器93-94
• 5.1.1 材料93
• 5.1.2 试剂及仪器93-94
• 5.2 实验方法94-95
• 5.2.1 CHA-MES诱导拟南芥雄性不育的处理94
• 5.2.2 花粉活力显微观察94
• 5.2.3 TRV-VIGS载体构建及农杆菌处理94-95
• 5.2.4 目标基因的半定量检测95
• 5.3 结果与分析95-103
• 5.3.1 ALS酶作为CHA-MES诱导植物雄性不育作用靶标的验证95-96
• 5.3.2 TRV-VIGS载体构建及干扰体系建立96-99
• 5.3.3 TRV介导的ALS基因沉默可诱导拟南芥植株发生雄性不育现象99-101
• 5.3.4 利用TRV-VIGS技术筛选其他与植物育性相关的候选基因101-103
• 5.4 讨论与结论103-105
• 第六章 全文总结与创新点105-107
• 6.1 全文总结105-106
• 6.1.1 CHA-MES诱导甘蓝型油菜雄性不育的超微结构观察105
• 6.1.2 甘蓝型油菜花药发育过程中物质代谢相关基因的调控网络105
• 6.1.3 CHA-MES诱导甘蓝型油菜雄性不育花药的差异转录组分析105-106
• 6.1.4 CHA-MES诱导植物雄性不育的靶标验证以及不育候选基因的筛选106
• 6.2 全文结论106
• 6.3 创新点106-107
• 参考文献107-118
• 附录118-126
• 缩略词126-127
• 致谢127-128
• 作者简介128-129

【参考文献】

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  本文关键词：化学杂交剂单嘧磺酯钠诱导甘蓝型油菜雄性不育分子机制的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：254084