‘白鸡冠’茶树响应光调控的基因差异及理化特征分析

发布时间：2017-03-18 11:04

  本文关键词：‘白鸡冠’茶树响应光调控的基因差异及理化特征分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新梢白化茶树是一种珍稀的种质资源,其叶色变化和特异性成分的机理成为茶叶科研的热点和难点。‘白鸡冠’作为一种可稳定遗传的白化芽叶茶树,是茶树育种的良好材料,对其生理生化和表达调控进行研究,有助于了解茶树体内的代谢变化及遗传变异,因而具有较高的研究价值与实际意义。本研究以武夷名丛‘白鸡冠’茶树为材料,从生理、生化和转录水平进行响应光调控及其叶色形成机理的研究。首先通过光照和温度试验,明确‘白鸡冠’属于光照敏感型白化类型。应用新一代高通量测序技术,构建‘白鸡冠’茶树转录组和差异基因表达谱(DGE),对差异表达基因(DEGs)进行GO功能注释与KEGG代谢通路分析,富集响应光调控和白化性状相关的基因,并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术验证差异基因表达谱数据、检测叶绿素生物合成相关的基因表达；应用透射电镜技术和酶活性试剂盒观测叶片叶绿体超微结构和过氧化物酶活性,探明表型与叶绿体发育、体内抗氧化防御酶的关系；采用分光光度法、高效液相色谱(HPLC)和气质联用(GC-MS)技术检测儿茶素组分及总量、茶多酚、氨基酸总量和香气组分,探明‘白鸡冠’表型与色素、主要呈味物质及香气的关系。主要研究结果如下：1.不同光照强度和温度试验表明,‘白鸡冠’属于光照敏感型白化茶树,其黄白叶色的形成,需要光照的诱导。2.以‘白鸡冠’3天处理组(淡绿色半叶及黄白色半叶,T3d_Z vs. T3d_W)和6天处理组(绿色半叶及黄白色半叶,T6d_Z vs. T6d_W)为材料,基于第二代测序技术进行转录组测序(RNA-Seq),构建了新梢白化茶树转录组,共获得16.1G clean reads数据量和88788条Unigene。与公共数据库比对后,共有35703条Unigene得到注释,约占总Unigene的40.2%。其中,24846条Unigene通过GO功能注释到47个分类,其中,生物过程的亚层次中,以细胞过程和代谢过程最多。细胞组分的亚层次中,注释到最多的分类为细胞、细胞部分和细胞器。分子功能的亚层次中,最有代表性的分类是结合、催化活性和转运活性。10213条Unigene通过KOG数据库注释到26个基因簇,其中一般性功能预测簇群代表了最大的类群,其次是翻译后修饰/蛋白翻转／伴侣蛋白,紧接着信号转导、翻译和细胞内运输和分泌。此外,脂质代谢,细胞骨架和细胞壁/细胞膜生物合成等与细胞结构密切相关的途径均被注释。8561条Unigene通过KO注释到第二层分类的31个通路,代谢途径主要包括碳水化合物代谢、能量代谢、脂类代谢、氨基酸代谢和其他次生代谢产物生物合成等；遗传信息处理注释到包括折叠、分类和降解、翻译、转录、复制和修复。环境信息处理注释到值得进一步深入研究的信号转导和膜运输途径。1652条Unigene通过Blast2G0软件注释分成25个转录因子家族,注释最多的为MYB转录因子,AP2结构域,同源异型盒,锌指蛋白,bZIP家族和bHLH家族。3.差异基因表达谱(DGE)分析结果取所有比较组合差异基因集的并集,总共得到6382个差异基因。3天处理组(T3d_Zvs. T3d_W)具有4072个显著性差异表达基因(上调1597个,下调2475个)。6天处理组(T6d_Zvs. T6d_W)的差异基因为4863个,上调差异表达基因比3天处理组多32个,下调差异表达基因比3天处理组多759个。两个处理组均表明,下调差异表达基因远远多于上调差异表达基因。‘白鸡冠’绿色半叶对比黄白色半叶,下调差异基因GO分类表明,前20的GO分类主要包括细胞质部分、叶绿体、质体、核糖体、核糖体合成、核糖核蛋白复合物的生物合成、核糖体的结构成分、一翻译、核糖核蛋白复合、质体部分、叶绿体部分、细胞成分的生物合成、类囊体、结构分子活动、细胞内的一部分、细胞内、细胞成分的组织或生物合成、细胞内的细胞器、叶绿体被膜以及叶绿体发育相关、叶绿素捕光蛋白相关的基因。上调基因GO注释结果表明,“氧化还原过程”占生物学过程比例最高；细胞组分分类中注释到细胞周边和细胞壁；氧化还原酶活性、核酸结合转录因子活性、序列特异性DNA结合的转录因子的活性在分子功能中占比最大。KEGG代谢通路富集分析表明,3天处理组和6天处理组显著富集光合作用、卟啉和叶绿素代谢、类胡萝卜素代谢、类黄酮合成途径等与叶色密切相关的代谢通路。此外,脂肪酸代谢及合成、不饱和脂肪酸的代谢(参与膜流动性)、氮代谢和次生代谢途径也显著富集,这与研究发现叶绿体膜结构降解、茶多酚及氨基酸成分显著变化相符。4.处理组间及处理间GO功能DAG富集分析两个处理组共有差异基因为2779个(上调928个,下调1851个),共有上调差异表达基因富集到与植物细胞壁密切相关的植物型细胞壁组织和木葡聚糖转移酶活性,以及叶绿体被膜功能基因。共有差异表达基因共鉴定了81个转录因子。其中,注释最多的为HLH/bHLH转录因子11个和MYB转录因子8个。此外,bZIP转录因子、乙烯响应转录因子、同源异形盒转录因子、WRKY转录因子各3个、NAC转录因子2个和Trihelix转录因子1个。这些转录因子家族多与响应环境变化相关。其中,HY5(属于bZIP家族)在光响应中起重要作用。处理间特有差异表达基因为131个(上调42个,下调89个),差异基因多为色素、次生代谢生物合成、光合系统II及过氧化物酶体相关基因。3天处理组、6天处理组和处理间(T6d_Z vs. T3d_Z)共有差异基因为72个。与对照相比,叶绿素生物合成相关基因谷氨酰-tRNA还原酶(hemA),镁螯合酶亚基H(CHLH),镁原卟啉IX甲基酯环化酶(CRD1),叶绿素酶(E3.1.1.14)均下调；萜类生物合成相关基因1-脱氧-1D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、萜合酶均上调,且DXS在遮荫条件下明显升高；类黄酮化合物生物合成途径相关基因花青素还原酶(E1.3.1.77)、无色花色素还原酶(LAR),类黄酮3’,5’-羟化酶(F3 5 H)均下调；叶绿体发育相关基因铁氧还蛋白(petF)、Rubisco酶大亚基结合蛋白(rbcL)均下调；光系统Ⅱ10kDa蛋白(psbR)、捕光复合体II的叶绿素a/b结合蛋白1(LHCB1)上调,psb27蛋白质(psb27)、反应中心X蛋白(psbX)下调；过氧化物酶体相关基因超氧化物歧化酶(SOD1, Cu-Zn家族)、酰基激活酶均下调。下调差异表达基因DAG富集分析表明,最终富集到5个基因参与光系统II稳定、13个基因参与叶绿体类囊体膜功能和7个基因参与光系统II功能。5. qRT-PCR验证富集通路相关基因利用qRT-PCR技术验证差异基因表达谱(DGE)数据,结果表明,3天处理和对照中,JAZ(茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白)基因与基因表达谱不相符,其余19个基因一致；6天处理和对照中,COP1 (E3泛素蛋白连接酶)、CHLD(镁螯合酶D亚基)、CHLI(镁螯合酶I亚基)基因与基因表达谱不相符。其余基因的表达趋势均与DGE数据相符合。总体而言,qRT-PCR检测结果与测序结果的趋势相一致。以‘白鸡冠’和‘肉桂’自然条件下生长的叶片为研究材料,检测叶绿素代谢途径相关基因的相对表达量,结果表明,叶绿素代谢合成相关基因POR(原叶绿素酸脂还原酶)在响应光调控和叶色形成中起重要作用。6.光照对‘白鸡冠’茶树超微结构及体内防御酶的影响研究通过转录组及基因表达谱分析表明,GO功能注释到的基因功能主要与叶绿体发育、光合作用和过氧化物酶体相关,因此,以自然条件下和遮荫条件下的‘白鸡冠’叶片为材料,观测叶片叶绿体超微结构和抗氧化防御酶活性,结果表明,在强光条件下,‘白鸡冠’叶绿体数目少且超微结构异常,光合膜结构降解,体内酶活性低；遮荫后,‘白鸡冠’叶片由黄白色转变为绿色,叶绿体类囊体膜结构重建,恢复正常形态,基粒片层结构致密发达,体内酶活性显著上升。7.光照对‘白鸡冠’茶树主要色素、呈味物质及香气代谢的影响KEGG代谢通路富集分析富集到的通路主要为卟啉和叶绿素代谢、类胡萝卜素生物合成、黄酮类化合物生物合成及萜类生物合成途径,因此,检测‘白鸡冠’叶色变化前后物质差异,结果表明,‘白鸡冠’叶色变化前后色素、呈味物质和香气变化明显。‘白鸡冠’遮荫转绿后,Ch1a、Ch1b、叶绿素总量、β-胡萝卜素显著增加。呈味物质主要表现为：6天处理即绿色半叶相比于对照黄白色半叶,非酯型儿茶素EGC、C和EC含量显著降低；氨基酸总量也显著低于对照,而咖啡碱略有上升,水浸出物略有下降,但二者未呈显著性变化。香气测定表明,处理间(T6d_Zvs. T3d_Z),芳樟醇未检测到,但检出乌龙茶的重要赋香成分橙花叔醇,同时水杨酸甲酯、香叶基丙酮均有上升。
【关键词】：茶树 白化 叶绿素缺失 叶绿体超微结构 转录组测序 差异基因表达谱 光照敏感型
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S571.1
【目录】：

• 摘要11-15
• ABSTRACT15-21
• 缩略词表21-22
• 第一章 前言22-36
• 1 新梢白化茶树生理生化及其叶色形成机理研究进展22-27
• 1.1 茶树新梢白化类型22-23
• 1.1.1 根据茶树与生态环境的关系分类22
• 1.1.2 根据茶树新梢的颜色分类22-23
• 1.2 生理水平研究23
• 1.2.1 显微及超微结构研究23
• 1.2.2 酶活性研究23
• 1.3 生化水平研究23-24
• 1.4 分子水平研究24-27
• 1.4.1 茶树芽叶白化种质DNA分子标记研究24-25
• 1.4.2 茶树新梢白化基因差异表达研究25-26
• 1.4.3 与品质和叶色相关基因的克隆26
• 1.4.4 茶树新梢白化蛋白质组学研究26-27
• 2 植物白化叶色产生机制27-30
• 2.1 外在因素27
• 2.2 内在因素27-30
• 2.2.1 光合色素生物合成途径中的基因突变27-29
• 2.2.2 叶绿体分化与发育相关基因的突变29
• 2.2.3 捕光色素蛋白复合体相关的基因突变29-30
• 2.2.4 光敏色素生色团生物途径中基因突变30
• 2.2.5 与光合系统无直接关系的基因突变30
• 3 RNA-SEQ和DGE技术及其在基因差异表达中的应用30-32
• 3.1 RNA-Seq和DGE技术原理及其优势31
• 3.2 RNA-Seq和DGE技术在茶树基因差异表达上的应用现状及前景31-32
• 4 本研究的目的及意义32-33
• 5 研究内容33-35
• 5.1 确定‘白鸡冠’茶树叶色白化的类型33
• 5.2 ‘白鸡冠’茶树响应光调控的转录组特征分析33
• 5.3 ‘白鸡冠’茶树响应光调控的基因表达谱差异分析33
• 5.4 ‘白鸡冠’茶树响应光调控和叶色白化相关基因的挖掘33
• 5.5 光照对‘白鸡冠’茶树超微结构及体内防御酶的影响研究33-34
• 5.6 光照对‘白鸡冠’茶树主要呈味物质及香气组分的影响研究34-35
• 6 技术路线35-36
• 第二章 光照和温度对‘白鸡冠,茶树新梢白化的影响36-47
• 1 材料与方法36-38
• 1.1 试验材料36-37
• 1.2 试验方法37-38
• 1.2.1 叶绿素含量检测37-38
• 1.2.2 数据统计与分析38
• 2 结果与分析38-45
• 2.1 ‘白鸡冠’在自然条件下的表型及叶绿素积累特性38-40
• 2.1.1 自然条件下表型特征38-39
• 2.1.2 自然条件下光合色素分析39-40
• 2.2 光照和温度对‘白鸡冠’茶树白化表型及色素含量的影响40-45
• 2.2.1 光强和温度对‘白鸡冠’茶树表型及色素含量的影响40-43
• 2.2.2 不同遮荫程度对‘白鸡冠’表型及叶绿素相对含量的影响43-44
• 2.2.3 半叶法遮荫对‘白鸡冠’茶树白化表型和叶绿素的影响44-45
• 3 讨论45-46
• 3.1 光照对新梢白化茶树表型性状的影响45-46
• 3.2 确定以外界遮荫进行取样46
• 4 小结46-47
• 第三章 ‘白鸡冠’茶树叶片应答光照的转录组分析47-62
• 1 材料与方法47-51
• 1.1 试验材料47
• 1.2 试验方法47-51
• 1.2.1 茶树总RNA提取及质量检测47-48
• 1.2.2 cDNA文库构建及Illumina高通量测序48-49
• 1.2.3 数据评估、组装及功能注释49-51
• 2 结果与分析51-60
• 2.1 茶树总RNA提取质量分析51-52
• 2.2 De novo转录本测序和组装结果52-53
• 2.3 基因注释53-60
• 2.3.1 功能注释结果统计53-55
• 2.3.2 GO分类55-57
• 2.3.3 KOG注释57-58
• 2.3.4 KEGG通路注释58-59
• 2.3.5 转录因子59-60
• 3 讨论60-61
• 4 小结61-62
• 第四章 ‘白鸡冠’茶树叶片差异基因表达谱(DGE)特征分析62-79
• 1 材料与方法62-64
• 1.1 试验材料62
• 1.2 试验方法62-64
• 1.2.1 RNA提取及质量检测62
• 1.2.2 文库构建及测序62
• 1.2.3 数据评估、组装及功能注释62-63
• 1.2.4 基因表达水平分析63
• 1.2.5 差异基因表达分析63-64
• 1.2.6 上调和下调差异表达基因火山图64
• 1.2.7 差异基因GO富集分析64
• 1.2.8 差异基因KEGG富集分析64
• 2 结果与分析64-77
• 2.1 测序数据的产出和表达谱reads的注释64-65
• 2.2 样品间相关性检验65-66
• 2.3 不同处理组之间的差异表达基因分析66-67
• 2.4 上调和下调差异表达基因火山图67-68
• 2.5 差异表达基因GO功能富集分析68-73
• 2.5.1 下调差异基因的GO富集分析68-73
• 2.5.2 上调差异基因的GO富集分析73
• 2.6 差异基因的KEGG代谢通路富集分析及其表达模式73-77
• 3 讨论77-78
• 3.1 无参转录组测序结合基因表达谱测序的适用性探讨77
• 3.2 DGE技术的高重复性及其高通量77-78
• 3.3 差异表达基因及其模式分析78
• 4 小结78-79
• 第五章 ‘白鸡冠’茶树响应光调控及叶色相关基因挖掘79-106
• 1 材料与方法79-81
• 1.1 试验材料79
• 1.2 试验方法79-81
• 1.2.1 茶树共有差异表达基因维恩图79
• 1.2.2 GO注释及DAG功能富集79-80
• 1.2.3 实时荧光定量PCR验证80-81
• 2 结果与分析81-104
• 2.1 不同遮荫处理时间差异基因集分析81-90
• 2.1.1 不同遮荫处理时间差异基因对比81
• 2.1.2 处理组间共有上调差异表达基因GO注释及其功能富集81-85
• 2.1.3 处理组间共有下调差异表达基因GO注释及其功能富集85-88
• 2.1.4 处理组共有差异表达基因鉴定转录因子88-90
• 2.2 处理组与对照组差异基因集分析90-95
• 2.2.1 处理组与对照组差异基因对比90-91
• 2.2.2 处理间(T6d_Z vs.T3d_Z)上调差异表达基因GO注释及其功能富集91
• 2.2.3 处理间(T6d_Z vs.T3d_Z)下调差异表达基因GO注释及其功能富集91-95
• 2.3 响应光调控及叶色相关基因实时荧光定量PCR验证95-104
• 2.3.1 RNA电泳图95-96
• 2.3.2 目的基因及内参基因扩增效率分析96-97
• 2.3.3 荧光定量PCR验证DEGs97-99
• 2.3.4 遮荫对‘白鸡冠’叶片叶绿素代谢途径关键基因表达的影响及其表达模式99-100
• 2.3.5 ‘白鸡冠’不同叶位叶绿素代谢途径相关基因表达模式分析100-104
• 3 讨论104-105
• 3.1 响应光信号的转录因子104-105
• 3.2 富集与细胞壁重构相关基因105
• 3.3 叶绿素合成途径基因受抑制105
• 4 小结105-106
• 第六章 ‘白鸡冠’茶树响应光调控的生理生化变化106-126
• 1 材料与方法107-112
• 1.1 试验材料107-108
• 1.2 试验方法108-112
• 1.2.1 叶绿体超微结构检测108-109
• 1.2.2 茶树体内防御酶及丙二醛检测109-111
• 1.2.3 光合色素测定111
• 1.2.4 茶树主要呈味物质测定111
• 1.2.5 茶树香气成分测定111-112
• 1.2.6 数据统计与分析112
• 2 结果与分析112-123
• 2.1 光照对叶绿体超微结构的影响112-115
• 2.2 光照对‘白鸡冠’茶树保护性酶酶活性及MDA变化115-117
• 2.2.1 遮荫前‘白鸡冠’茶树保护性酶酶活性及MDA含量115-116
• 2.2.2 遮荫处理对‘白鸡冠’茶树保护性酶酶活性及MDA的影响116-117
• 2.3 光照对‘白鸡冠’光合色素的影响117-118
• 2.4 光照对‘白鸡冠’主要呈味物质的影响118-120
• 2.4.1 不同季节‘白鸡冠’主要呈味物质分析118-119
• 2.4.2 光强对‘白鸡冠’主要呈味物质的影响119-120
• 2.5 光强对‘白鸡冠’茶树香气的影响120-123
• 3 讨论123-125
• 3.1 光照对新梢白化茶树叶绿体结构的影响123-124
• 3.2 光照对新梢白化茶树体内过氧化物酶的影响124
• 3.3 光照对新梢白化茶树色素积累的影响124
• 3.4 光照对新梢白化茶树主要呈味物质的影响124-125
• 3.5 光照对‘白鸡冠’茶树香气成分的影响125
• 4 小结125-126
• 第七章 总结与讨论126-131
• 7.1 本研究主要研究结果126-127
• 7.2 讨论127-130
• 7.2.1 ‘白鸡冠’叶色表型及叶绿体发育与光合系统Ⅱ密切相关127-128
• 7.2.2 遮荫降低光氧化损伤,修复叶绿体结构128
• 7.2.3 ‘白鸡冠’白化表型与光合色素代谢和叶绿体发育密切相关128-130
• 7.3 展望130-131
• 参考文献131-139
• 附录139-150
• 致谢150-152
• 作者简介152-153

  本文关键词：‘白鸡冠’茶树响应光调控的基因差异及理化特征分析，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：254330