绵羊骨骼肌高表达miRNA靶基因的高通量获取及部分候选靶基因生物功能研究

发布时间：2017-03-19 18:05

  本文关键词：绵羊骨骼肌高表达miRNA靶基因的高通量获取及部分候选靶基因生物功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为了掌握绵羊骨骼肌中mi RNA的表达情况,深入探索其在绵羊骨骼肌发育过程中的表达特点及靶向调控的基因,进一步阐明miRNA对绵羊骨骼肌发育的调控机制,为优质肉羊品种的培育提供理论基础及新的育种手段。本研究首先以萨福克羊骨骼肌为材料,使用芯片技术对其骨骼肌中miRNA的表达情况进行了检测,并以此为基础对绵羊骨骼肌中高表达miRNA从以下4个方面开展了深入研究:首先,使用PCR-SSCP(Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism)技术对绵羊骨骼肌中高表达miRNA前体序列在4个不同产肉性能绵羊品种中的突变进行检测,寻找在不同产肉性能绵羊品种间差异较大的突变,分析相关突变与绵羊产肉性能之间的关系。选择7个对miRNA前体序列二级结构能值影响不同的突变,构建真核表达载体,通过真核细胞表达试验及qRT-PCR检测其对miRNA加工成熟的影响;其次,使用qRT-PCR技术检测绵羊骨骼肌中高表达miRNA在绵羊胚胎期第40 d、60 d、80 d、100 d、120 d以及初生、6月龄和周岁绵羊骨骼肌组织中的表达变化,并分析其与绵羊骨骼肌发育之间的关系;第三,使用本实验室开发的建库技术,构建绵羊胚胎期第60 d和成年羊骨骼肌中高表达miRNA的靶基因文库;第四,以绵羊骨骼肌卫星细胞为材料,采用qRT-PCR和Western Blot技术研究miR-133过表达和抑制表达对绵羊骨骼肌卫星细胞生长以及miR-133的4个候选靶基因表达的影响,分析miR-133对绵羊骨骼肌卫星细胞生长的调控作用。通过以上试验,本研究得到了以下结果:1.利用芯片技术在绵羊骨骼肌中共检测到261个miRNA,其中58个为已报道的绵羊miRNA,其余203个在绵羊中尚未见报道;且这261个miRNA在同时期绵羊骨骼肌中的表达量不尽相同,其中有22个高表达的miRNA,其表达量占检测到mi RNA总表达量的89%;2.首次在16个miRNA前体序列中检测到共计49个突变,其中包括41个单碱基突变和8个插入/缺失突变,另有6个miRNA前体序列没有检测到突变;对其中的3个突变在5个产肉性能不同的绵羊品种共计640份基因组样品中进行了进一步研究,发现miR-133a前体序列的CCC插入/缺失突变与绵羊的产肉性状高度相关;89.8%的突变对miRNA前体二级结构和成熟加工有影响,且突变对二级结构能值影响越大,突变位置离miRNA成熟序列越近,对miRNA的成熟加工影响亦越大;3.绵羊骨骼肌中22个高表达miRNA在绵羊骨骼肌发育的不同时期表达量会出现上调或者下调,其表达量按照4种基本的模式发生变化。胚胎期大部分mi RNA出现了两个低表达期,分别是胚胎期的40 d至60 d和120 d;4.分别成功构建了绵羊胚胎期和成年期骨骼肌高表达miRNA靶基因文库。胚胎期文库和成年期文库分别测序250个单克隆,得到246条和239条有效序列,阳性克隆率分别达到85%和79%。分别有132条和124条ESTs序列与NCBI中unigene序列匹配,占靶基因文库的53.66%和51.88%;5.mi R-133过表达对绵羊骨骼肌卫星细胞的增殖具有抑制作用;miR-133在绵羊骨骼肌卫星细胞中可靶向调控Rhoa,CDC42,TAGLN2基因的表达,造成其蛋白表达量极显著下调,但是对MSN基因没有调控作用。miR-133在Rhoa和TAGLN2的CDS区分别有一个靶位点,其余靶位点均位于3’UTR区。通过上述研究,对绵羊骨骼肌中miRNA的表达情况及其靶基因有了较为全面的认识,对骨骼肌不同发育阶段miRNA的表达变化情况及其功能有了更为深入的掌握。以上研究工作将为进一步阐明绵羊骨骼肌发育的分子调控机制奠定基础,为优质肉羊品种的培育提供坚实的理论基础及新的育种手段,将对肉羊育种工作产生积极地推动作用。
【关键词】：绵羊 骨骼肌 miRNA 靶基因
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略词表(Abbreviations)10-11
• 引言11-12
• 第一章 文献综述 哺乳动物 miRNA 与其靶基因作用机制研究进展12-24
• 1.1 miRNA的转录及加工成熟12-13
• 1.2 miRNA与靶基因的结合13-14
• 1.2.1 动物miRNA的“种子序列”13
• 1.2.2 miRNA 3’端序列对“种子序列”与靶位点结合的稳固13-14
• 1.2.3 miRNA与其靶基因的结合位点14
• 1.3 miRNA基因的多态性对其加工成熟的影响14-15
• 1.4 miRNA对靶基因的调控15-17
• 1.4.1 抑制mRNA翻译起始15-16
• 1.4.2 翻译起始后的调节16-17
• 1.4.3 miRNA调节mRNA的降解17
• 1.5 获取miRNA靶基因的方法17-19
• 1.5.1 生物信息学分析的方法17-18
• 1.5.2 差异表达谱分析法18
• 1.5.3 miRISC免疫共沉淀法18-19
• 1.6 哺乳动物肌肉miRNA及其靶基因研究进展19-21
• 1.6.1 哺乳动物肌肉miRNA研究进展19-20
• 1.6.2 肌肉miRNA靶基因研究进展20-21
• 1.7 哺乳动物骨骼肌发育及其分子调控机制21-23
• 1.7.1 哺乳动物胚胎期肌生成21-22
• 1.7.2 成年动物肌肉组织的维持及修复22
• 1.7.3 肌生成的分子调控机制22-23
• 1.8 研究目的和意义23-24
• 第二章 绵羊骨骼肌中miRNA表达研究24-31
• 1. 材料与方法24-27
• 1.1 试验材料24-25
• 1.2 方法25-27
• 1.3 数据处理及分析27
• 2. 结果与分析27-29
• 2.1 总RNA提取质量检测27-28
• 2.2 绵羊骨骼肌中miRNA表达情况28
• 2.3 芯片检测数据的验证28-29
• 3. 讨论29-30
• 4. 小结30-31
• 第三章 绵羊骨骼肌中高表达miRNA前体序列的多态性研究31-55
• 1. 材料与方法31-40
• 1.1 试验材料31-32
• 1.2 试验方法32-40
• 1.3 数据分析40
• 2. 结果与分析40-52
• 2.1 绵羊骨骼肌高表达miRNA前体序列突变40-42
• 2.2 miRNA前体序列突变的特点42-43
• 2.3 miRNA前体序列突变对其二级结构及稳定性的影响43-46
• 2.4 序列突变在不同产肉性能绵羊品种间的差异46-49
• 2.5 miRNA前体序列突变对其成熟加工的影响49-52
• 3. 讨论52-54
• 3.1 绵羊骨骼肌高表达miRNA前体序列的突变52-53
• 3.2 miRNA前体序列突变与其成熟加工的关系53-54
• 4. 小结54-55
• 第四章 绵羊不同发育阶段骨骼肌中miRNA表达情况研究55-66
• 1. 材料与方法55-59
• 1.1 试验材料55-56
• 1.2 方法56-59
• 1.3 数据分析59
• 2. 结果与分析59-64
• 2.1 骨骼肌总RNA提取及检测59
• 2.2 22个绵羊骨骼肌高表达miRNA在不同发育阶段骨骼肌中的表达情况59-62
• 2.3 miRNA靶基因预测及其KEGG通路分析62-64
• 3. 讨论64-65
• 4. 小结65-66
• 第五章 绵羊骨骼肌高表达miRNA靶基因的研究66-83
• 1. 材料与方法66-75
• 1.1 试验材料66-67
• 1.2 试验方法67-75
• 2. 结果与分析75-81
• 2.1 胚胎期和成年羊骨骼肌总RNA大剂量提取结果75
• 2.2 总RNA中混入基因组的消化及评估75-76
• 2.3 mRNA纯化效果76-77
• 2.4 靶基因文库的构建及初步评估77-79
• 2.5 文库阳性克隆挑选及菌落PCR鉴定79
• 2.6 靶基因文库测序结果比对分析79-81
• 3. 讨论81-82
• 4. 小结82-83
• 第六章 miR-133对绵羊肌卫星细胞生长的影响及其靶基因的验证83-98
• 1. 材料与方法83-90
• 1.1 试验材料83-85
• 1.2 试验方法85-89
• 1.3 数据分析89-90
• 2. 结果与分析90-94
• 2.1 绵羊骨骼肌卫星细胞培养及转染90
• 2.2 miR-133对绵羊骨骼肌卫星细胞生长的影响90-91
• 2.3 miR-133对绵羊骨骼肌中4个候选靶基因表达的影响91-94
• 3. 讨论94-97
• 3.1 绵羊骨骼肌卫星细胞的生长特性及转染特性94-95
• 3.2 miR-133对绵羊骨骼肌卫星细胞基因的靶向调控95-97
• 4. 小结97-98
• 结论98-99
• 创新点99-100
• 参考文献100-110
• 致谢110-111
• 附录111-114
• 作者简介114-115
• 附件115

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