奶牛乳腺上皮细胞microRNA表达谱构建及乳脂代谢相关microRNA的筛选和验证

发布时间：2019-11-26 02:45

【摘要】：本文旨在鉴定奶牛乳腺上皮细胞micro RNA(以下简称mi RNA)的表达谱,研究高脂和低脂奶牛原代乳腺上皮细胞mi RNA的表达谱差异,探讨mi RNA调控奶牛乳脂合成的分子机制。首先筛选乳脂率差异显著的中国荷斯坦奶牛各3头,利用组织块接种法分离培养两种具有不同乳脂合成特性的原代乳腺上皮细胞(primary mammary gland epithelial cell,p MEC),并对其生物学特性及甘油三酯含量进行鉴定。然后,在成功构建两细胞小RNA文库的基础上,利用Solexa测序及生物信息学分析技术对mi RNA在乳腺上皮细胞中的表达模式进行鉴定,分析两细胞mi RNA的表达谱差异。最后利用双荧光素酶报告基因检测系统、种子定点突变技术、茎环q RT-PCR及Western Blot等分子生物学实验验证手段对两细胞文库差异表达、且与乳脂代谢相关的mi RNA及其候选靶基因和功能进行验证。主要研究结果如下:1.筛选获得乳脂率性状差异显著的中国荷斯坦奶牛各3头,首先利用组织块接种法分离和培养乳腺上皮细胞,分别命名为p MEC-HH(高脂奶牛原代乳腺上皮细胞)和p MEC-LL(低脂奶牛原代乳腺上皮细胞)。分离纯化后,通过生长曲线、特异性分泌蛋白的RT-PCR及免疫荧光、染色体核型分析等生物学鉴定手段,获得了大量具有正常表型和生物学特性的奶牛原代乳腺上皮细胞。甘油三酯含量测定结果显示两细胞的乳脂含量差异显著,说明体外培养的原代细胞保留了活体乳腺组织乳脂的合成和分泌特性。2.利用Solexa高通量测序技术鉴定奶牛乳腺上皮细胞的mi RNA表达谱,结果共鉴定出292个牛已知保守mi RNA,其中252个mi RNA在两细胞中共表达,17个mi RNA/mi RNA*仅在p MEC-HH中表达,21 mi RNA/mi RNA*仅在p MEC-LL中表达;共鉴定出116个新的候选mi RNA,其中32个mi RNA在两细胞中共表达,80个mi RNA仅在p MEC-HH中表达,84个mi RNA仅在p MEC-LL中表达。3.两文库表达谱差异分析结果显示,共鉴定出97个差异表达的已知mi RNAs(p0.05),其中有91个mi RNA在两文库中共表达;与p MEC-HH相比,38个mi RNA在p MEC-LL中表达上调,59个mi RNA在p MEC-LL中表达下调;差异表达的97个已知mi RNA候选靶基因的GO和KEGG功能注释分析结果表明,两文库共预测到9887个候选靶基因,注释到305个生物过程。其中与脂代谢相关的通路中脂肪酸代谢注释到61个基因,脂肪酸的生物合成注释到13个,脂肪酸碳链的延长注释到32个,不饱和脂肪酸的生物合成注释到28个。4.利用茎环qPCR方法,验证了13个已知mi RNA在乳腺上皮细胞和乳腺组织的表达量,并将结果与Solexa测序结果进行比对,三者mi RNA差异表达的趋势具有高度一致性,表明细胞水平mi RNA鉴定的敏感性和可行性。5.利用靶基因预测和功能注释等生物学分析技术以及茎环q PCR和Western Blot的试验验证手段,筛选出4个与乳脂代谢调控有关的差异表达mi RNA,分别是:bta-mi R-33a,候选靶基因ELOVL5、ELOVL6;bta-mi R-21*,候选靶基因ELOVL5和PTGIS;bta-mi R-152,候选靶基因PTGS2、PRKAA1和UCP3;bta-mi R-224,候选靶基因是LPL、GST和ALOX15。6.利用双荧光素酶报告基因检测技术对筛选获得的bta-mi R-152进行靶基因鉴定及功能验证研究,结果表明bta-mi R-152可以通过特异性地靶向结合UCP3基因,影响奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量,但细胞活性在转染前后无显著差异,证明bta-mi R-152可作为探讨奶牛乳脂代谢调控机制的重要候选mi RNA。成功构建了高脂和低脂奶牛原代乳腺上皮细胞,二者mi RNA的表达谱差异显著。筛选获得4个参与调控奶牛乳脂合成代谢的mi RNA,分别是bta-mi R-33a、bta-mi R-21*、bta-mi R-152和bta-mi R-224。进一步的靶基因鉴定和功能验证研究表明bta-mi R-152可以通过靶向识别UCP3基因,影响奶牛乳腺上皮细胞中乳脂的合成和代谢。
【图文】：

图 1.1 奶牛乳腺乳脂合成及调控机制示意图Figure 1.1 The regular mechanisms of milk fat synthesis in bovine mammary tissue图片摘自 Bional 等（2008）[2]1.1 脂肪酸从头合成

图 2.1 miR-33 调控脂代谢机制示意图Figure 2.1 The diagram of miR-33 regulating the lipid metabolismmiR-33可抑制胆固醇转运和脂肪酸氧化过程中涉及的相关基因表达。图片引自GIGLI等（2013）[61]。基因英文全称见论文英文字母缩略表。miR-33 represses the expression of genes involved in cholesterol export and fatty acid
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
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本文编号：2565977