嗜水气单胞菌感染后团头鲂免疫相关microRNA的筛选及其功能研究

发布时间：2019-12-06 14:10

【摘要】：团头鲂(Megalobrama amblycephala),俗称武昌鱼,是我国一类重要的大宗淡水养殖经济鱼类。最近几年由于养殖密度不断的扩大以及生态环境的恶化等原因,各类疾病频发。在这其中,由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的细菌性败血症对于团头鲂养殖业的危害最大。到目前为止还没有有效的预防和治疗措施。MicroRNAs(miRNAs)是一类在免疫反应过程中发挥重要作用的非编码小的单链RNA分子。但是到目前为止关于团头鲂感染嗜水气单胞菌相关的miRNAs研究未见报道。为了更好的了解miRNA在团头鲂抵抗嗜水气单胞菌感染中的重要作用,我们首先通过高通量测序技术对团头鲂肝脏组织未感染嗜水气单胞菌(0 h)和感染后4 h、24 h的miRNA转录组进行了分析,鉴定筛选了与团头鲂感染嗜水气单胞菌免疫相关的mi RNAs。随后对筛选的免疫相关miRNAs其调控关系和功能做了进一步的分析鉴定。主要研究结果如下:1.通过高通量测序技术构建了团头鲂肝脏组织未感染嗜水气单胞菌(0 h)和感染后4 h、24 h 3个小RNA库。通过分析分别获得了11,244,207条、9,212,958条和7,939,157条clean reads。通过生物信息学分析鉴定到171个保守的miRNAs和62个新的miRNAs。通过RT-PCR,我们随机验证了10个新的miRNAs的存在。差异表达miRNAs分析发现,分别有61个和44个miRNAs在感染后4 h和24 h呈显著上调或者下调的表达趋势。随后通过荧光定量PCR检测了随机挑选的9个miRNAs,它们在团头鲂肝脏感染嗜水气单胞菌后的表达模式与高通量测序结果一致。差异表达miRNAs靶基因预测和靶基因Gene Ontology(GO)、Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes(KEGG)注释的分析结果表明嗜水气单胞菌能够影响团头鲂的多种生物学通路。在预测的靶基因中共鉴定到94个免疫相关的基因。通过荧光定量PCR检测了随机筛选的免疫相关miRNAs在团头鲂感染嗜水气单胞菌后肝脏中的表达模式。最后,通过双荧光素酶报告载体实验初步验证了这些miRNAs与其相应靶基因的关系。由以上结果推测差异表达miRNAs可能通过调控相应的靶基因进而参与了抵抗细菌入侵的免疫反应。这些研究结果加深了我们对于miRNA在团头鲂感染嗜水气单胞菌后免疫反应中重要作用的认识,同时也可以促进开发有效的疾病预防措施和分子标记,为团头鲂抗病育种提供理论基础。2.差异表达miRNAs靶基因预测结果显示转铁蛋白(TF)和转铁蛋白受体基因(TFR)是miR-375的靶基因。荧光定量PCR分析发现感染嗜水气单胞菌后团头鲂肝脏中TF和TFR的表达显著上调,而miR-375发生显著下调,miR-375与靶基因呈现相反的表达趋势。随后通过过表达实验和双荧光素酶报告载体实验验证了miR-375通过作用于TF和TFR的3’UTR从而抑制其表达。基于TF和TFR在铁稳态调控中的重要作用,我们由此推测,miR-375在团头鲂铁稳态和抵抗细菌入侵中发挥着重要的作用。3.差异表达miRNAs靶基因预测结果显示miR-146a、miR-29a和miR-457b-5p共同靶向作用于TRAF6基因的3’UTR。双荧光素酶报告载体实验验证了miR-146a和miR-29a可以靶向作用于TRAF6基因的3’UTR。随后在团头鲂鳍条细胞中过表达或者抑制miR-146a和miR-29a后,TRAF6相应的受到抑制或者出现上调表达,进一步证实了TRAF6是mi R-146a和mi R-29的直接靶标。另外,我们发现在细菌感染后,肝脏、脾脏和肾脏组织中miR-146a、miR-29a和TRAF6蛋白表达均有显著变化,总体上均是先升高后下降。LPS刺激CIK细胞后,miR-146a和miR-29a均出现显著上升的趋势,在12 h到达最高,最后在48 h恢复至正常水平。因此推测miR-146a和miR-29a在鱼体抵抗细菌感染免疫反应中发挥着重要的作用。此外,在CIK细胞中过表达miR-146a和miR-29a后,TLR/NF-κB下游免疫相关基因NF-κB p65、NF-κB p52、IL-6和TNF-α均受到抑制,其中miR-146a对IL-6没有显著的抑制作用。在CIK细胞中敲降miR-146a和miR-29a后,用LPS刺激后发现相应的下游基因发生显著上调。综上推测,miR-146a和miR-29a作为负调控因子通过靶向调控TRAF6基因,进而参与调控TLR/NF-κB信号通路,在鱼体先天性免疫反应中起到重要的作用。
【图文】：

miRNA的生成和作用（Zanetal2014）

-2 茎环引物法检测 miRNA 表达原理图（Chen et al 2 Schematic for stem-loop RT-PCR for miRNA（Chen et a术术（miRNA microarray）是一类快捷、灵敏度高 miRNA 及其表达模式的技术。它是高通量测序且已经广泛的应用于探究 miRNA 在发育（Roroce 2009）和疾病发生（Latronico and Condor但是其劣势主要是不能对 miRNA 进行绝对定Rosa and Brivanlou 2009）。术
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943

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本文编号：2570415