DF-1细胞中禽流感病毒免疫相关基因比较分析及免疫缺陷型细胞株重构

发布时间：2017-03-24 08:15

  本文关键词：DF-1细胞中禽流感病毒免疫相关基因比较分析及免疫缺陷型细胞株重构，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是从禽类中分离出来的A型流行性感冒病毒各种亚型的总称。目前,该病毒的分离和疫苗制备仍依赖于适龄鸡胚,效率低、耗能高,且不可避免地存在外源病毒的污染。因此,应用生物反应器的细胞培养技术进行疫苗生产是提高疫苗质量、降低生产耗能、推动动物疫苗制造技术升级的必由之路。禽源DF-1细胞系的建立有望替代鸡胚进行疫苗生产,然而,该细胞系不能稳定培养AIV,且病毒的抗原产量低于鸡胚,限制了其大规模应用。鉴于此,本研究拟采用基因修饰技术对DF-1细胞系进行改造,以期获得稳定传代的禽源转化细胞株,提高AIV的复制能力。本研究首先比较分析了高致病性H5N1与低致病性H9N2 AIV在DF-1细胞中的复制能力,并采用定量PCR方法检测了上述两个亚型AIV感染DF-1细胞后不同时间点10个固有免疫相关基因(Mx1、OASL、ISG12、IFIT5、IFN-α、IFN-β、IRF7、USP18、SST及KHSRP)的表达差异,筛选差异表达的基因,并分析其在抗AIV感染中的功能。在此基础上,分别利用mi RNA和慢病毒介导的RNAi技术沉默干扰素受体基因(IFNAR1和IFNAR2),分析IFNAR1和IFNAR2敲低或沉默对AIV复制的影响,并筛选靶基因沉默的稳定细胞株,以提高AIV的复制能力。结果表明:1.DF-1细胞支持H5N1和H9N2亚型AIV复制,表现为不同的复制能力,H5N1病毒复制能力显著高于H9N2。分析10个固有免疫相关基因的差异性表达,其中,干扰素刺激基因(Mx1、OASL、ISG12)和免疫调节基因SST应答于H5N1与H9N2病毒感染而诱导相似的基因表达模式,在6 hpi或9 hpi即上调基因表达,并持续至15 hpi。IFN-α和IFN-β基因在早期感染阶段(3、6和9 hpi)未被显著诱导表达,仅在12 hpi和15 hpi时显著上调其m RNA表达,提示在病毒感染的早期阶段IFN基因的表达被抑制。IFIT5与USP18基因表达模式不同于其它基因,其应答于H9N2亚型AIV感染而持续上调表达,在15 hpi达到峰值;然而,H5N1诱导的两个基因在15 hpi显著下调表达,可区别DF-1细胞中两种不同亚型的病毒感染。与上述不同的是,免疫调节基因IRF7和KHSRP显著应答于H9N2病毒感染,在3 hpi或6 hpi显著上调了基因表达水平,并持续至15 hpi;然而,这两个基因对H5N1病毒感染不应答,具有亚型依赖性;且在病毒感染后的各个时间点(6、9、12和15 hpi),H9N2病毒感染诱导的上述两个基因m RNA表达水平显著高于H5N1病毒,可显著区分DF-1细胞中两种不同亚型的AIV感染,并为深入探讨IRF7和KHSRP在控制和调节不同亚型AIV复制机制方面的功能研究奠定了理论基础。2.通过对IFNAR1和IFNAR2基因m RNA的定量分析,筛选得到敲低IFNAR1基因表达的重组质粒MR-A3和敲低IFNAR2基因表达的重组质粒MR-B2和MR-B3。3个有效mi RNA转染DF-1细胞后下调了IFN-α和IFN-βm RNA表达水平。然而,仅MR-B2转染的细胞上调了Mx1、OASL和IRF7基因m RNA的表达,并促进了AIV的复制,提示Ⅰ型IFN信号通路的激活(Mx1、OASL和IRF7基因m RNA表达的改变)可能对AIV复制起关键作用;而MR-A3质粒转染的细胞抑制了AIV的复制,说明mi RNA在基因沉默中存在非特异性作用。本实验虽未筛选到靶基因稳定沉默的纯化细胞株,但为后续AIV抗病毒机制研究及免疫缺陷型细胞株的构建奠定了理论基础。3.本研究设计并合成了IFNAR1和IFNAR2基因的sh RNA序列,与p LKO.1载体构建重组质粒,重组质粒经细胞转染和定量筛选,得到敲低IFANR1基因表达重组质粒p R1-sh1、p R1-sh3和敲低IFNAR2基因表达的重组质粒p R2-sh3。有效重组质粒的sh RNA序列交由上海吉凯基因公司进行慢病毒包装。慢病毒以最适感染比(MOI 0.5)感染DF-1细胞,以嘌呤霉素(4μg/m L)加压筛选并纯化单克隆细胞株。选择7株目的细胞株和1株阴性对照细胞株进行了分析,其中5株靶向IFNAR1基因而筛选,其余两株细胞株靶向IFNAR2基因筛选;荧光显微镜下观察,分析的7株目的细胞株形态均一,纯化效果好。靶向IFNAR1基因的5株细胞株中,3株(DF1-R1-sh1-3、DF1-R1-sh3-1和DF1-R1-sh3-2)显著下调了IFNAR1 m RNA表达水平,且其中的两株(DF1-R1-sh1-3、DF1-R1-sh3-1)在36 hpi提高了AIV的复制能力,分别提高至亲本细胞的4.6倍和4.0倍。靶向IFNAR2基因的两株细胞株均下调了IFNAR2基因m RNA表达水平,但它们对病毒的滴度无影响。本实验筛选得到的病毒复制能力提高的2株DF-1细胞转化细胞株满足本研究的要求。总之,本研究证实了IFN-α/β和ISGs应答于H5N1和H9N2病毒感染而诱导不同的表达模式,并筛选到不同亚型之间显著差异表达的免疫调节基因IRF7和KHSRP。而且,本研究证实了干扰素受体基因(IFNAR1和IFNAR2)敲低或沉默能促进AIV复制,并成功建立了两株IFNAR1基因稳定沉默的细胞株,提高病毒的复制滴度为亲本细胞的4~5倍。本研究对深入研究AIV致病机理、推动疫苗生产体系具有一定的理论意义和实际应用价值。
【关键词】：DF-1细胞 禽流感 免疫相关基因 细胞株 复制
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 缩略词表13-15
• 氨基酸的简写符号15-16
• 第一章 研究综述16-49
• 1. 禽流感16-22
• 2. 细胞系22-24
• 3. 宿主抗病毒应答24-28
• 4. 免疫相关因子28-37
• 5. 细胞系构建技术37-43
• 6. 基因表达调控研究方法及发展趋势43-47
• 7. 本文研究目的和意义47-49
• 第二章 禽流感病毒免疫相关基因的比较分析49-70
• 1. 材料与试剂49-51
• 2. 主要仪器设备51
• 3. 实验方法51-56
• 4. 实验结果56-66
• 5. 讨论66-68
• 6. 本章小结68-70
• 第三章 miRNA介导禽流感免疫缺陷型DF-1细胞系的重构70-89
• 1. 材料与试剂71-72
• 2. 主要仪器72
• 3. 实验方法72-79
• 4. 实验结果79-86
• 5. 讨论86-87
• 6. 本章小结87-89
• 第四章 慢病毒介导禽流感免疫缺陷型DF-1细胞系的重构89-110
• 1. 材料与试剂89-90
• 2. 主要仪器90-91
• 3. 实验方法91-99
• 4. 实验结果99-107
• 5. 讨论107-109
• 6. 本章小结109-110
• 结论110-111
• 参考文献111-126
• 攻读博士学位期间发表的学术论文126-127
• 致谢127-128
• 附录128-138

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本文编号：265338